用单克隆抗体研究对虾白斑症病毒（WSSV）的黏附蛋白
白斑症病毒(wSSV)引起的对虾白斑病自1993年暴发以来，给对虾养殖造成了严重的损失。有关对虾白斑症病毒病，已积累了丰富的的研究资料。由于WSSV囊膜上的黏附蛋白与宿主细胞受体的结合在WSSV吸附和侵入过程中起关键作用，因此研究黏附蛋白与细胞受体以及两者之间的相互作用是探讨WSSV感染的分子基础。本论文进行了中国对虾血细胞的原代培养，用 WSSV感染培养的细胞，检测了病毒对培养细胞的感染以及在细胞内的增殖。并用酶联免疫吸附法(ELISA)、免疫印迹法(DOT-BLOT)、原代培养的对虾血细胞以及螯虾动物模型检测筛选WSSV的中和单抗。同时，提纯WSSV囊膜蛋白，研制了囊膜蛋白VPl9的单抗，检测了其中和性。具体的研究内容和结果如下。
从中国对虾心脏中抽取血细胞，用7种培养基培养，以2×L-15为基本培养基，加入20[％]新生牛血清，20[％]GIT培养基，2[％]的葡萄糖，调节pH到7.2-7.4，25℃培养，倒置相差显微镜观察发现对虾血细胞可活20天左右。
用不同浓度的白斑症病毒病毒液感染原代培养的对虾血细胞，倒置相差显微镜观察感染细胞的死亡状况，发现被感染细胞的病变情况不同。用lO<'-1>-10<'-6>浓度白斑症病毒梯度稀释液感染原代培养的中国对虾血细胞，利用相差显微镜连续5d定时观察了血细胞的死亡情况；用10<'-3>浓度病毒液感染培养的血细胞不同时间和lO<'-1>-10<'-8>浓度病毒液感染培养的血细胞10d，通过WSSV的混合单抗和过氧化物酶(HRP)联二抗进行免疫吸附测定检测被感染血细胞内的病毒。结果显示，lO<'-1>-10<'-2>浓度病毒液感染的血细胞明显缩小，有死亡现象，可见细胞碎片，细胞数目逐渐减少，细胞碎片聚集成堆；lO<'-3>-10<'-4>浓度的病毒液感染的血细胞明显缩小，细胞聚集成堆，但无明显死亡，较10<'-2>之浓度病毒液感染的血细胞出现细胞病变时间明显延长；lO<'-5>-10<'-6>浓度病毒液感染的血细胞在5d内无明显的细胞病变。血细胞在接种10。浓度病毒液后，细胞内病毒在第7d达到最大值。lO<'-1>-10<'-8>浓度的病毒液感染血细胞10d后，被感染细胞内的病毒有增殖。
用细胞免疫化学方法证实 WSSV 可以感染原代培养的对虾血细胞，表明用ELISA和DOT-BLOT检测抗WSSV的单克隆抗体的中和性。先用ELISA方法确定最适的病毒和单抗的结合浓度与比例，病毒和提取的血细胞膜的最适结合比例，然后选择此浓度的病毒和各单抗结合，然后用结合有单抗的病毒吸附中国对虾的血细胞膜，结合到膜上的病毒用WSSV的混合单抗检测，结果显示单抗2D2可以部分阻断WSSV和血细胞膜的结合。原代培养的中国对虾血细胞也被用于WSSV的体外中和实验，培养的血细胞分别感染病毒、病毒和单抗的结合物，倒置相差显微镜观察被感染的细胞，结果显示感染病毒的细胞病变严重，细胞孔内细胞碎片成堆，而结合有单抗的病毒感染的细胞无明显死亡，细胞轻微聚集。从中和结果看出单抗2D2和684有中和力。
用螯虾动物模型检测WSSV各单抗的中和效果，不同浓度的粗提WSSV液与各单抗(杂交瘤细胞培养上清)分别孵育，然后结合有单抗的病毒液腹部皮下注射螯虾，每天观察被感染的螯虾的死亡情况。结果显示单抗与病毒结合物感染的螯虾组出现死亡的时间和达到100％死亡率的时间比感染病毒的螯虾组晚，而且，取被感染的螯虾鳃用间接免疫荧光法检测，结果发现感染相同时间的结合有中和单抗2D2和282的病毒感染组螯虾的鳃里病毒阳性信号弱于病毒感染组的阳性信号。
十二烷基磺酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳分离提纯的病毒，把WSSV的囊膜蛋白VPl9从凝胶上洗脱提纯，免疫小鼠，取免疫小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞融合，用间接免疫荧光技术和WETSERN-BLOT技术筛选出一株阳性杂交瘤细胞，其培养上清既可以和自然状态的病毒反应，又可以和变性的病毒蛋白反应。然后克隆检测出的阳性杂交瘤细胞，生产抗VPl9的单抗。抗vPl9单抗的中和性用ELISA检测，结果显示此单抗2Dll可以降低病毒与中国对虾血细胞膜的结合。还用了螯虾体内中和实验检测VPl9单抗的中和效果，结合有单抗的病毒腹部皮下注射螯虾，每天观察螯虾的死亡情况，结果显示单抗2Dll与病毒结合物感染的螯虾组出现死亡的时间和达到100％死亡率的时间比感染病毒的螯虾组晚，说明2Dll有一定的中和病毒的能力，VPl9在病毒感染中起作用。
综上所述，本文用四种方法检测筛选出了WSSV的有中和性的单克隆抗体2株2D2和684，为寻找WSSV的黏附蛋白提供了方法和依据，为探明WSSV感染的分子机制提供了研究基础。同时，研制出了WSSV囊膜蛋白VPl9的单抗，检测本文介绍了国内外ABS树脂的生产和消费情况。叙述了挤出级ABS研制的全过程，包括接枝主干胶乳聚丁二烯合成，乳液接枝聚合，ABS粉料的制备，共混物SAN的合成，ABS粉料和SAN的共混。系统阐述了挤出级ABS研制所需的大粒径胶乳的合成方法、反应机理及研究进展。对胶乳粒径的控制方法进行了探讨，介绍了适时补皂法等六种增大胶乳粒径的方法。考察了在挤出级ABS树脂的合成过程中SAN树脂的分子量，ABS树脂的橡胶含量对制得的ABS树脂性能的影响，聚丁二烯胶乳粒径、聚丁二烯胶乳凝胶含量等因素对接枝聚合反应及制得的ABS树脂性能的影响。并将实验室最终制得的挤出级ABS树脂的性能与市场上进口的同类产品的性能进行了比较。
测试结果表明，随着SAN树脂分子量的增加，制得的挤出级ABS树脂的拉伸强度、冲击强度、弯曲强度和弯曲模量都迅速增加，熔融指数逐渐下降。随着ABS树脂中橡胶含量的不断增加，其拉伸强度、弯曲强度、弯曲模量和熔融指数逐渐下降，而冲击强度则不断增加。随SAN比例的增加，产品的冲击强度下降，加工流动性、硬度及表面光洁度增加。通过对两种不同粒径的聚丁二烯胶乳的对比发现：聚丁二烯胶乳粒径较大时，制得性能良好的挤出级ABS树脂时接枝共聚物的接枝率范围变化较宽。通过对聚丁二烯胶乳凝胶含量的考察，发现聚丁二烯胶乳的凝胶含量在70％左右时，可制得综合性能良好的挤出级ABS树脂。对比发现，最终制得的挤出级ABS树脂的性能已经达到或超过了市场上的挤出级ABS树脂。
白斑症病毒;对虾血细胞;单克隆抗体;黏附蛋白
中国海洋大学
博士
水生生物学
战文斌
2006
中文
S945.46
90
2007-08-07（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）