青岛文昌鱼p23基因的克隆、鉴定、表达、纯化和功能分析
p23蛋白作为热激蛋白90(Hsp90)的辅助分子伴侣(cochaperone)，在真核细胞内对许多重要的调控因子和信号蛋白具有调节作用。文昌鱼(Amphioxus)是介于无脊椎动物和脊椎动物之间的过渡类型，是研究脊椎动物进化的珍贵材料。利用分子生物学手段和生物信息学方法，研究文昌鱼p23基因的结构、进化和表达，可以揭示文昌鱼p23基因与无脊椎动物和脊椎动物p23基因之间的相互关系及其表达模式的异同，有助于从分子水平上阐释脊椎动物的起源和进化。本文从青岛文昌鱼(Branchiostoma belcheri tsingtaunese)肠cDNA文库(本实验室保存)中，克隆了具有完整编码框的p23基因(AmphiP23)，并对其结构、表达和进化展开了研究。AmphiP23全长1455bp，编码170个氨基酸组成的蛋白。该蛋白在氨基酸水平上与人、小鼠、鸡、爪蟾、斑马鱼、海鞘、果蝇、线虫等的p23蛋白的相似性为25.3％-34.7％，与人的tsp23相似性为21.2％，且具有典型的p23保守域(8-114残基)和p23蛋白共有的保守残基(8W，79K，86W，89L，106W,，人的氨基酸序号)。系统进化分析发现，无脊椎动物和脊椎动物p23蛋白分化为两个组群，而Amphip23介于脊椎动物和无脊椎动物p23蛋白之间，说明脊椎动物和无脊椎动物p23基因是在5.5亿年前由共同的祖先分化而成。人tsp23蛋白位于脊椎动物进化枝的基部，说明tsp23可能比脊椎动物p23蛋白更原始，脊椎动物p23和tsp23可能是由类似于文昌鱼AmphiP23基因发生了基因倍增形成的。
Northem blot结果表明，AmphiP23在文昌鱼成体组织中广泛表达(包括脊索、鳃、肌肉、肠、精巢和卵巢)，相反，人p23在小鼠表达于除心脏和骨骼肌之外的所有组织(肝、肾、肺、胸腺、卵巢、脾和胃)，而人tsp23基因的表达则仅限于心脏和骨骼肌，这种人p23和tsp23在小鼠的互补表达图式与Amphip23广泛表达可能说明，p23在发生基因倍增形成p23和tsp23之前，是广泛表达，而到脊椎动物出现两个基因和功能上的分化。原位杂交分析表明，AmphiP23在文昌鱼早期神经胚的近轴中胚层、脊索和神经管开始表达，随着神经胚的发育，转录发生在体节中胚层和神经管的前部，到一天幼虫，AImphiP23在脑泡的背部、后部体节和表皮细胞中表达，而二天幼虫则主要在脑泡表达，在身体的其它部分也有微弱信号，说明AmphiP23可能与前后轴形成有关。
利用原核表达系统表达并纯化了文昌鱼p23的融合蛋白，获得了分子量大约为22kDa的纯化蛋白，N-末端测序表明蛋白表达正确。利用融合蛋白制备了多克隆抗体，Western blot结果表明，抗体能与文昌鱼p23蛋白特异性杂交。另外，我们免疫组织化学的结果初步表明，p23在成体各种组织中分布，证明文昌鱼p23蛋白在生物体内是一个广泛分布并具有多重功能的蛋白质。
生物信息学分析发现，p23蛋白是带有较多净负电荷的酸性蛋白，文昌鱼p23蛋白具有p23蛋白大多数的特征性结构，与其它p23蛋白的氨基酸序列具有相同的疏水性趋势。文昌鱼p23蛋白同源模建的三维结构表明，其组成残基的98.2％位于合理位置，与人p23蛋白三维结构比较发现，其表面保守残基和表面静电势具有较高的相似性，因此，我们认为文昌鱼p23蛋白的三维结构的模建是合理的，并推断文昌鱼p23蛋白在体内可能具有和其同源蛋白相同的功能。
文昌鱼;多克隆抗体;同源模建
中国海洋大学
博士
海洋生物学
张士璀
2006
中文
Q959.287
107
2007-08-07（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）