牙鲆淋巴囊肿病毒单克隆抗体的研制及应用
淋巴囊肿病(Iymphocystis disease LCD)是一种世界范围流行的鱼类病毒病，病原是淋巴囊肿病毒(Iymphocystis disease virus，LCDV)。患病鱼的主要症状是体表长有皮肤瘤状和菜花状的赘生物，丧失商品价值。自1997年在威海地区养殖的牙鲆中首次发生以来，该病迅速蔓延至浙江、辽宁、河北等省沿海地区。近年来该病一直在养殖牙鲆中流行，给水产养殖业造成的经济损失高达数百亿元之巨。
本论文对淋巴囊肿病毒纯化方法、病毒结构蛋白及其抗原性、单克隆抗体的制备、病毒培养及其感染牙鲆鳃细胞的动态变化进行了研究，取得了以下结果：优化了病毒的提纯方法并使之程序化；判定病毒结构蛋白带共有22条，且三条蛋白带具有抗原性；制备了单克隆抗体，并应用多种免疫学方法证实了单抗针对病毒的特异性，确认了五个蛋白为病毒的衣壳蛋白，并且在这五个蛋白多肽上具有线形抗原决定簇；发现病毒感染鳃细胞后24小时之内，开始复制，48-72小时达到顶峰。
优化的LCDV病毒提纯的方法为：首先剥离囊肿组织表面的薄膜，然后采用多次匀浆处理肿瘤组织，尔后将组织匀浆液于650xg和1 800xg分别离心20 min，将离心获得的上清液配成30[％](W／W)蔗糖溶液，4℃条件下进行78，500×g，1 80 min超速离心，病毒沉淀用TNE缓冲液重悬后进行蔗糖密度梯度离心即可。纯化的LCDV病毒负染后，电镜观察发现其呈近似于圆形的多角形，结构完整。LCDV病毒经SDS-PAGE，硝酸银染色，电泳图谱清晰显示其结构蛋白共有22条，且分子量主要集中在123-26 kDa之间。应用兔抗LCDV血清分析结构蛋白的抗原性，结果显示分子量为123.55、65.292和54.438 kDa的3条蛋白带发生了免疫反应，其中分子量为65.292 kDa的蛋白带反应强度明显高于其它2条蛋白带。
以纯化的LCDV为抗原免疫：Balb/C小鼠，采用单克隆抗体技术经细胞融合、筛选、有限稀释法克隆共获得了1 3株单克隆抗体(1A8、1D7、286、2F6、2D11、2G6、3A5、3G3、3D6、3G12、4C8、4D9、486)。ELISA初步筛选结果显示，这13株杂交瘤细胞分泌的抗体的吸光值相对于其他阳性杂交瘤细胞的较高，免疫荧光抗体技术筛选结果显示特异性块状荧光信号集中在囊肿细胞的细胞质边缘部分,且多个荧光信号相连呈现链圈状。采用Western blotting方法对单抗特异性结合的病毒蛋白多肽的分子量进行了测定。结果显示单抗1D7、286能识别一条分子量约为116 kDa蛋白多肽;单抗3G3与两条蛋白多肽反应,分子量分别为116kDa和90kDa;单抗3D6与分子量约为46kDa和65kDa的两条多肽反应;单抗4C8能识别一条分子量约为35kDa蛋白多肽;单抗1A8、2F6、2D11、2G6、3A5、3G12、4D9、486没有反应条带;应用金标免疫电镜技术定位克隆的13株单抗识别的抗原决定簇,结果发现胶体金颗粒集中吸附在LCDV病毒粒子囊膜周围,且背景清洁,无散在的金颗粒或其他污染物,该结果直接证明这13株单抗的抗原决定簇均位于LCDV病毒核衣壳上。结合免疫电镜和Westernblotting结果,可以断定分子量为116 KDa、90kDa、65kDa、46kDa和35kDa的蛋白多肽为淋巴囊肿病毒衣壳蛋白,并且具有线性抗原决定簇。
另外以LCDV病毒粗提液感染牙鲆鳃细胞系,1～2天出现明显细胞病变现象(CPE)。以抗LCDV病毒单抗为第一抗体,运用免疫荧光抗体方法、免疫细胞化学在接种病毒的鳃细胞中检出阳性,证实了牙鲆鳃细胞系为淋巴囊肿病毒的敏感细胞系。同时采用免疫荧光抗体技术,对LCDV病毒感染鳃细胞的时间动力学作了较为系统的观察,结论是24小时之内,病毒在细胞中开始复制,48.72小时达到顶峰。
淋巴囊肿病毒;单克隆抗体;牙鲆
中国海洋大学
博士
水产养殖
战文斌
2006
中文
S965.3;S941.41
108
2007-08-07（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）