淋巴囊肿病毒（Lymphocystis disease virus）核酸疫苗的免疫效果评价及安全性研究
随着人们对水产品需求量的增加，水产养殖业得到了快速发展。但大规模高密度养殖造成的水环境污染，致使水产病害日趋严重，特别是病毒性疾病造成的损失更加惊人。淋巴囊肿病毒(Lymphocystis disease virus，LCDV)，属于虹彩病毒科(Iridovhidae)病毒，是在我国养殖牙鲆、真鲷、大菱鲆、军曹鱼以及野生虾祜鱼等多种鱼中暴发的首例病毒。目前，世界上报道的、可被淋巴囊肿病毒感染的鱼类至少有42科、125种以上，其中海水鱼占30科。
继南方养殖石斑鱼中发生淋巴囊肿病以来，1997年山东省荣成市养殖牙鲆也发生了此病，后来迅速蔓延到威海、乳山、青岛等主要养殖区；1998年，河北省唐山、乐亭等也大量发生该病毒病。由于鱼类被感染后，其口唇、鳃、鳍、尾及体表各处会长出大小不一的肿瘤，形象丑陋、活力减弱，有直接或间接的死亡，所以造成的经济损失是严重的。
当前，我国海水鱼养殖者大多使用化学合成或抗生素类药物“抵抗”疾病，但由于药物残留、诱变抗药菌株及水体污染等副作用，导致了我国水产品在出口时遇到种种障碍、严重阻碍了经济的发展。近年的研究认为，基因工程疫苗，是在病毒病防治中替代化学药品和抗生素的最好选择。与传统疫苗相比，核酸疫苗具有独特的优势，如生产成本低、可与其他免疫原组成多价疫苗、可诱导机体产生强烈而持久的体液免疫和细胞免疫并具有良好的安全性等。目前，水产养殖界核酸疫苗研究尚处于起步阶段，国外主要集中在鲑、鳟鱼类的IHNV、VHSV、SVCV、SHRV等传染性病毒病的防治上。但迄今未见淋巴囊肿病毒基因工程疫苗的研究报道。
本论文对应用分子克隆技术构建的牙鲆淋巴囊肿病毒核酸疫苗DEGFP-N2-LCDV-cn-MCP0.6kb以及应用生物信息学设计的6种核酸疫苗 (pcDNA3.1+/LTEl,2,3和pcDNA3.1+/L29A，B，C)在真核细胞COS7及牙鲆胚胎干细胞(FEC)中的表达定位进行了研究；并在牙鲆体内进行了免疫效果评价；对核酸疫苗pEGFP-N2-LCDV-cn-MCP0.6kb在牙鲆体内的存留部位、时间及表达、安全性及两种免疫佐剂脂质体和CpG基序的免疫激活作用进行了研究，并初步探讨了其免疫机制。上述研究为淋巴囊肿病毒核酸疫苗的生产应用和产业化提供了重要的理论依据。本论文的主要成果如下:1、对本实验室应用分子克隆技术和生物信息学方法构建的核酸疫苗pEGFP-N2-LCDV-cn-MCP0.6kb及pcDNA3.1+/LTE 1,2,3和pcDNA3.1+/L29A,B,C进行了在真核细胞COS7和牙鲆胚胎干细胞(FEC)中的表达定位研究。结果表明,几种核酸疫苗均可在COS7及FEC等真核细胞中有效表达。
2、重组质粒在牙鲆体内的分布与表达研究,结果显示,免疫接种7d后,注射点周围肌肉、注射点对面体侧肌肉、肠、鳃、肾、肝、脾脏、生殖腺各部位都存在质粒;3个月后,除注射部位外、各组织基本检测不到质粒的存在。荧光显微检测显示:实验组在接种核酸疫苗后84h,注射点周围肌肉、注射点对面体侧肌肉、肠、鳃、肾、脾脏、肝等部位均有荧光表达,60d荧光减弱,90d脾脏仍有弱荧光,对照组无黄绿色荧光。RT-PCR检测结果显示:免疫接种后第7d和第20d,牙鲆不同组织内均有624bp的目的基因表达。因此,核酸疫苗pEGFP-N2-LCDV-cn-MCP0.6kb可分布于受免牙鲆不同的组织内、并在一定时间内持续表达,从而可不断提供抗原并刺激机体产生特异性免疫反应。
3、不同注射途径和剂量的免疫效果研究表明,牙鲆肌肉及皮下注射0.1μg核酸疫苗pEGFP-N2-LCDV-cn-MCP0.6kb,22d后外周血、脾脏、前肾和肠粘膜中的淋巴细胞增殖及呼吸爆发明显增强,且随剂量的增加而增强;但15μg的剂量与5μg的剂量淋巴细胞增殖以及呼吸爆发活性增加差别不大。
研究表明,肌肉注射疫苗时,初期抗体水平略低于皮下注射、但后期明显升高、且抗体水平随剂量增加而提高。肌肉注射对淋巴细胞增殖的诱导优于皮下注射。本研究结果说明,该核酸疫苗可激活牙鲆的体液及细胞免疫反应。
4、佐剂对核酸疫苗pEGFP-N2-LCDV-cn-MCP0.6kb的免疫效果研究表明,脂质体、CpG ODN-2006和CpG ODN-1670序列,均可显著增强该核酸疫苗的免疫活性、提高牙鲆的细胞免疫和体液免疫应答,是有应用前景的核酸疫苗佐剂。
5、肌注核酸疫苗后,牙鲆体内MHCⅠ、Ⅱ的表达研究证明:MHCI在鳃、后肠和脾脏中高度表达;在血液、肝脏和头肾中度表达;在心脏和肌肉中低度表达;免疫接种7d后肝脏、头肾的表达增加;后肠略有减少,肌肉、血液等没有变化;免疫接种20d后心脏、血液、头肾、肝脏的表达增加；肌肉、脾脏、后肠等没有变化。MHCII在脾脏、鳃、头肾中高度表达，在后肠、血液、肝脏中度表达，在肌肉、心脏中很低或稍微可见的表达； MHCII免疫接种7d后脾脏、头肾、鳃的表达增加，后肠略有减少，其他组织没有变化；免疫接种20d后脾脏、头肾、血液的表达增加，心脏略有增加，其他组织没有变化。
6、核酸疫苗的安全性研究表明，pEGFP-N2-LCDV-cn-MCP0．6kb不与牙鲆染色体发生整合，也不会对环境中的抗性菌数量和种类产生影响，受试牙鲆注射部位无红肿等现象、也未对内脏组织造成影响。表明该核酸疫苗对于受免牙鲆和环境都是安全的。
7、核酸疫苗pEGFP-N2-LCDV-cn-MCPO．6kb的田间试验证明，PBS组、空载体组及疫苗免疫组的生瘤率分别为92.3％、90.4％、5％，疫苗组的生瘤率比PBS组和空载体组分别降低87.3％和85.4％，所以该疫苗具有明显的抑瘤效果。
重组质粒;免疫效果;核酸疫苗
中国海洋大学
博士
海洋生物学
孙修勤
2006
中文
S942.3;S941.41
134
2007-08-07（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）