条斑紫菜原生质体转基因的研究
紫菜养殖业是我国海藻养殖业的支柱产业之一，也是主要的出口创汇海产品。近年来，随着紫菜栽培业规模的逐年扩大，对紫菜优良品种的供应要求越来越高。紫菜易于养殖，藻体形态结构简单，细胞发育分化易于调控，酶解紫菜产生原生质体及原生质体的再生技术已经成熟，易于进行分子水平上的研究。因此，开展紫菜基因工程研究，利用现代分子生物学的手段培育紫菜新品种是十分必要的，也具备现实可行性。同时，也有望将紫菜作为生物反应器来生产有用的外源蛋白。但是，目前紫菜的转基因研究还处于起始阶段，主要是应用高等植物中常用的启动子如CaMV 35S等研究报告基因在紫菜中的瞬间表达。因此，本论文以条斑紫菜(porphyra yezoensis)的营养体纯系PY—qingdao1为材料，选择条斑紫菜的内源β一微管蛋白(tubulin)基因的侧翼序列为调控序列，通过微管蛋白基因及侧翼序列的克隆和分析、表达载体的构建、基因转化方法的建立等系统地进行了转基因研究，初步建立其转基因体系。
在本论文的前期研究中，我们选取青岛地区野生条斑紫菜，利用酶解制备原生质体进行再培养的方法培育了营养体纯系PY—qingdaol。
根据真核细胞β一微管蛋白序列进行比对结果，设计简并引物，采用针对高GC含量模板的PCR体系，从条斑紫菜PY Qingdao—l的基因组DNA中扩增出969bp的B一微管蛋白基因的部分序列，根据序列测定分析结果，设计反向PCR引物，并选用一系列在已知序列中不存在的识别位点的限制型内切酶对于条斑紫菜基因组。DNA进行酶切，然后自连，以此为模板，进行反向PeR，克隆反向PCR片段并测序，序列拼接后共得到2799bp，提交到Genbank(AY221630)。其中编码区1377bp，GC含量60.57％，比报道过的一些红藻的β一微管蛋白基因编码区GC含量高，共编码458个氨基酸，没有内含子，表现出很强的密码子偏好性。其上游664bp序列GC含量高达66.42％，未发现TATA box，CAM、box等上游调控序列。其下游758bp的序列中没有典型的AA[JAM．polyA信号，只存在一个CAYTG的高等植物下游的保守序列。将推测的蛋白质全序列与Genbank中其他真核细胞的β一微管蛋白进行序列分析，构建进化树，结果表明条斑紫菜与其他红藻和真菌聚为一个簇群，而不与包括绿藻在内的绿色植物构成一个簇群。
通过PCR分别扩增得到含有B一微管蛋白基因编码区上游序列663bp和下游序列337bp的两个片段，构建了瞬间表达载体pATubGUS，通过电击法转化条斑紫菜原生质体，24小时后通过分光光度法检测到GUS基因的表达，且表达水平超过pBl221，说明β—微管蛋白基因的上游序列有启动子活性，下游序列有终止子的作用。利用上游序列中的酶切位点构建瞬间表达载体pBITub5L、pBITtub5M和pBITub5S分别含有起始密码子上游663bp、543bp和289bp的序列，结果证明663bp和543bp序列有启动子活性，而289bp的序列基本无启动子活性。通过PCR扩增得到含有终止密码子下游337bp和431bp的片段，构建表达载体pUCTubGUS和pUCTTubGUS31，瞬间表达的结果证明两者都有终止子活性，而且对于瞬间表达水平没有明显的区别，推测AAGAAA(终止密码子下游29l—296)在转录终止中起到了主要作用，CAYTG(终止密码子下游416—420)对于条斑紫菜转录的终止作用可能影响不大，或3’调控序列337bp下游载体上类似序列起到相同的作用。
农杆菌介导的转化除用于农杆菌天然的宿主，也成功应用于丝状真菌、酵母、甚至人类培养细胞HeLa细胞的基因转化中。为在条斑紫菜原生质体中建立农杆菌介导的基因转化方法，构建了农杆菌的双元表达载体pCAMBIA330lTub5L，和pCAMBIAl302TubCAT。在100 μM乙酰丁香酮(AS)的诱导下，根癌农杆菌EHAl05(含有pCAMBIA302TubCAT)的与条斑紫菜原生质体共培养48小时后，进行氯霉素抗性筛选和脱菌处理，收集培养物，检测到pCAMBIAl302TubCAT、转化组中CAT的活性比对照组高，说明cat基因有作为选择标记基因的可能性。利用含有pCAMBIA3301或者pCAMBIA3301Tub5L的农杆菌EHAl05分别侵染原生质体，检测到转化组GUS的表达量高于对照组，而且pCAMBIA3301转化组显示出了更高GUS活性。证实农杆菌介导的转化方法可以应用于条斑紫菜原生质体瞬间表达的研究。
综上所述，本论文将反向PCR的技术首次应用于条斑紫菜β—微管蛋白基因及其侧翼序列的克隆，分离了一个没有内含子的B—微管蛋白基因的序列，并分析其序列的特殊性。首次将内源β—微管蛋白基因的侧翼序列用于条斑紫菜原生质体的瞬间表达，得到一个表达量明显高于常用的CaMV 35S启动子的内源性启动子。并将农杆菌介导的基因转化方法首次应用于条斑紫菜原生质体瞬间表达的研究，建立了简便易行的农杆菌介导的条斑紫菜原生质体基因转化的方法，其操作性明显优于现在的条斑紫菜原生质体转化方法如电击法、基因枪法等。这些研究为进一步通过转基因的手段改良紫菜品种，实现以紫菜为生物反应器来大量生产外源蛋白奠定了重要的基础。
条斑紫菜;微管蛋白基因;内源性启动子;农杆菌
中国海洋大学
博士
水产品加工与贮藏工程
管华诗;于文功
2006
中文
Q949.292.1;S985.42
106
2007-08-07（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）