花鲈肌肉生长抑素基因（MSTN）克隆、表达及其基因打靶载体的构建
物质损伤线粒体，降低线粒体膜电位，增加细胞内钙离子浓度及显著抑制PCNA表达，增强Caspase-3活性和降低C—fos和C-jun蛋白表达有关。泥蚶多肽在50mg／kg、100mg／kg、200mg／kg剂量范围内，对荷Lewis肺癌小鼠的肿瘤具有抑制作用，其机理与该物质降低bcl-2mRNA、P53和P16蛋白在肿瘤组织中的表达，增高Bax蛋白的表达有关，但并不影响肿瘤组织中fas mRNA和C-myc的表达。毒理学研究结果表明，泥蚶多肽对小鼠自发活动次数和麻醉犬心率、血压、心电图各间期及呼吸频率和深度无明显影响。小鼠静脉注射的最大耐受量大于2g／kg，小鼠皮下注射的最大耐受量大于5g／kg。长期静脉注射本物质对Beagle犬体重、血液学指标、血液生化指标、心电图、尿常规均无明显影响，对24个脏器病理组织检查均无明显影响。Ames实验证明泥蚶多肽的Ames实验为阴性结果；对小鼠骨髓细胞微核试验结果提示，其对动物体细胞没有明显的致突变作用；对小鼠睾丸精原细胞染色体畸变实验结果显示，其对动物生殖细胞也没有明显的致突变作用。静脉注射250mg／kg、100mg／kg、50mg／kg、10mg/Kg泥蚶多肽对孕鼠体重、胚胎形成、胎鼠生长发育、胎鼠骨骼发育以及胎鼠内脏器官等观察指标无明显影响。
综上所述，本研究结果证实泥蚶多肽具有明显的体外、体内抗肿瘤作用，作为一种小分子多肽，无明显的毒副作用，还能提高机体的免疫功能。显然，这种独特的双重作用有利于肿瘤病人的综合治疗和康复。本研究为进一步开发、应用泥蚶生物资源，造福人类提供客观依据，预示着作为一种潜在的药用海洋生物，泥蚶具有巨大的开发应用价值。
选择程序构建了MSTN同源重组载体，命名为p-MSTN-NK。同源重组载体p-MSTN-NK被转移到LJESl细胞中，2天后，500 μg／ml G418用于正选择，2.5 μg／ml GANC用于负选择。经过25天的药物选择，转化空载体pBluescript ll KS的对照组细胞全部死亡；经G418筛选转化了p-MSTN-NK的一组细胞形成了大约2000个抗性克隆；经G418和GANC双选择转化了p-MSTN-NK的另一组细胞平均获得了43个双抗性克隆，负筛选使同源重组富集效率大约为51倍。最终，在多批转化的细胞中，28个双选择克隆被扩增培养。
总之，本文首次克隆获得了5396 bp的MSTN基因组序列。通过RT-PCR技术和MSTN基因启动子驱动GFP基因的表达，特征了MSTN基因在不同组织、不同胚胎发育时期及几个不同细胞系中的表达方式。另一方面，优化了脂质体介导的转化条件，建立了表达GFP基因的ES细胞株，通过长期药物筛选，该细胞株仍保持多能性。构建了MSTN同源重组载体，通过G418和GANC双选择，进行了基因打靶初步实验。
花鲈;肌肉生长抑素;基因转移;同源重组
中国海洋大学
博士
海洋生物学
陈松林
2006
中文
Q959.483;Q78
102
2007-08-07（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）