重要海水养殖鱼类MHCⅡ基因克隆、表达及多态性分析
主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)Ⅱ基因是一种编码细胞表面糖蛋白的异二聚体,是高度多态的基因,且其某些基因型与生物体抗病力存在一定的相关关系。本研究以我国重要海水经济养殖鱼类真鲷、大菱鲆和牙鲆为实验材料,利用PCR、RT-PCR、RACE、Southem blot等技术研究了MHCⅡ基因的克隆、表达、等位基因的多态性以及等位基因的多态性与鱼体抗病力之间的关系,为筛选抗病相关MHC Ⅱ B基因标记,建立基因标记辅助选育技术提供基础。
(1)根据本实验室建立的真鲷cDNA文库中EST序列测序,得到全长为1191bp的MHC Ⅱ BcDNA序列(Genbank accession NO.:AY848956),经BLAST分析为MHC Ⅱ B基因。和其它脊椎动物的全长基因组序列比较,设计特异性引物进行内含子的PCR扩增,得到2494bp的基因组全序列。以rsbMHC2bln1N和rsbMHC2bIn4C为引物进行PCR扩增,扩增产物包括完整开放阅读框序列,有7个真鲷个体被用于分析真鲷MHC ⅡB的多态性,结果得到6个不同的等位基因。为了研究真鲷MHC Ⅱ B的位点数量,用同一对引物对同一真鲷个体的开放阅读框的cDNA序列进行了PCR扩增。在所测序的11个不同的阳性克隆中,有4个不同的cDNA序列被鉴定出。另外,利用rsbMHC2b3'IJTRN和rsbMHC2b3'LITRC为引物,扩增同一真鲷个体的3'UTR,有12个阳性克隆被测序,测序结果中有2个不同的序列被鉴定出,表明MHCⅡB基因至少存在两种不同的位点。用Southernblot方法进一步验证真鲷MHCⅡB基因的位点数。用MEGA3.0构建系统进化树,结果发现真鲷MHCⅡB基因的7种不同的序列聚类到一簇,另外与鲈鱼的亲缘关系较近,与丽鱼、虹鳟、大西洋鲑的亲缘关系次之,与小鼠和人类的最远。以正常鱼和鳗弧菌感染后真鲷组织为材料,以反转录合成的第一链cDNA为模板,应用RT-PCR半定量检测方法对大菱鲆的MHC Ⅱ B基因组织表达特点进行了研究,结果表明,在正常真鲷组织中,其中较强的表达于鳃、脾、头肾、肾、胃、小肠和心脏中,在肌肉和血中表达最弱。在鳗弧菌感染后的肝脏、脾脏、小肠和头肾组织中,卡方检验表明,MHCIIB基因表现为具有极显著差异的表达(X<'2>=103.79,248.19,19.44和87.38,P<0.01)。
伴随全球海洋渔业资源全面衰退和生态系统的不断退化，海洋渔业资源的管理理念正在发生深刻变化；以海洋生态系统动力学研究为基础的生态系统水平上的渔业资源管理已成为一种必然的发展趋势。
鳀鱼(Engraulis iaponicus)是黄海生态系统的关键种。20世纪80年代中后期鳀鱼资源尚未大规模开发之时的资源量在300万吨的水平上波动；90年代后期随着渔业产量的迅猛发展，鳀鱼资源大幅衰退，至2003年越冬群体资源降至仅有10万吨，资源已近崩溃边缘。
本文在我国海洋生态系统动力学研究的框架下，利用近年在鱼类资源和鱼类群体结构声学一拖网评估方法方面的研究成果和1985年以来黄海鲲鱼资源的声学评估调查资料，对黄海鳀鱼群体的群体结构、亲体一补充关系以及鳀鱼群体的可持续产出等种群动力学特征进行了评估与分析，并对其资源可持续利用问题进行了探讨，以期为鳀鱼种群对人类活动和自然变化的响应机制研究提供依据，为实现生态系统水平上的鲤鱼资源管理提供基础资料。主要结果如下。
1. 建立了利用声学数据和不定点拖网数据评估鲲鱼体长结构和年龄结构的方法，并利用该方法对1999年来的鲲鱼群体结构进行了评估。通过对越冬群体和生殖群体结构的分析结果表明，黄海鳀鱼群体已呈现明显的小型化、低龄化趋势，主要表现在平均体长的减小和平均年龄的降低，分别由1992年的11.6cm和1.7龄降为2004年的10.1cm和1.4龄：体长分布由单峰型变为双峰型，1龄补充群体所占比重越来越大。但大个体、高龄鱼尚未从群体中完全消失，最大体长1 7cm和最大年龄4龄的群体结构仍在；这对黄海鳀鱼资源的恢复具有重要意义。
2.分别采用VPA、最小二乘法和迭代逼近法对黄海鳀鱼的自然死亡系数、补充量、繁殖率和亲体一补充关系进行了评估。结果表明，20世纪90年代后期和MHC ⅡB基因和其它已知的生物的MHCⅡ基因的序列比较和进化树分析。同时利用RT-PCR方法进行了牙鲆MIHC Ⅱ基因在正常组织、不同发育阶段的胚胎、鳗弧菌感染后得组织中的表达分析。利用1对特异引物分别对42尾抗病牙鲆和42尾感病牙鲆进行了包括部分外显子1、完整的内含子1和大部分外显子2序列的PCR扩增。从811个阳性克隆的测序结果中，得到13种不同的核苷酸序列，分别编码13种不同的氨基酸序列。经卡方检验13种基因型在两种群体中的出现频率，其中大部分基因型于两种群体中同时存在；基因型g和h只出现于抗病群体中；基因型1只出现在感病群体中。对核苷酸替换类型和位点进行分析，结果发生在多肽结合位点的非同义碱基替换(dN)与同义碱基替换率(dS)的比值远远大于非多肽结合位点的dN／dS，说明核苷酸替换主要发生在exorn2的多肽结合位点(Protein binding region，PBR)上。
主要组织相容性复合体;组织特异性表达;多态性
中国海洋大学
博士
海洋生物学
陈松林
2006
中文
S967;Q78
140
2007-08-07（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）