青岛文昌鱼体液酚氧化酶：分离、纯化、鉴定、诱导形成及其基因克隆
酚氧化酶(phenoloxidase)又称为酪氨酸酶(tyrosinase，ECl.14.18．1)。它是一种含铜的酶，能够催化单酚羟化成二酚(如多巴)，把二酚氧化成醌；醌在非酶促条件下形成最终的反应产物黑色素(Lerch K，1988)。酚氧化酶在脊椎动物和无脊椎动物中得到了广泛的研究，然而在进化上占据关键位置的文昌鱼中的酚氧化酶的研究却比较少。我们实验室以前的研究证实文昌鱼皮肤粘液中存在酚氧化酶和酚氧化酶原，并对其组织分布和抗菌活性及其在胚胎发育过程中的变化进行了研究。然而，在文昌鱼体液中是否存在酚氧化酶(一种可能在文昌鱼的免疫和防御系统中担任重要角色的酶)，目前还不清楚。
我们以青岛文昌鱼(Branchiosroma belcheri tsingtauense)为实验材料，首先，用分光光度法和电泳与生化染色相结合技术检测，发现酚氧化酶存在于文昌鱼体液中，且主要以酶原形式存在；其最适温度是30℃-35℃，最适pH是7.0—7.5。酚氧化酶原可以被外源性激活剂如胰蛋白酶、酵母聚糖和脂多糖激活；在10 mM钙离子存在，外源激活剂引起的激活作用明显增强。但是外源激活剂引起的激活作用可以被蛋白酶抑制因子(STI和pNPGB)所抑制。另外，非变性电泳结合酶特异性染色证明酚氧化酶分子量约150 kDa，变性后为三条带，其分子量约44、46和72 kDa。这是有关对头索动物文昌鱼体液中存在酚氧化酶和酚氧化酶原的首次报道。
为进一步研究文昌鱼体液中酚氧化酶的特性，我们用硫酸氨分级沉淀、凝胶过滤层析、离子交换层析三种分离纯化技术相结合，从文昌鱼体液中纯化出了酚氧化酶。纯化的酚氧化酶用非变性电泳显示一条分子量约150 kDa的带，而变性后为三条带，其分子量约44，46和72 kDa。这说明文昌鱼体液中的酚氧化酶可能是一个通过二硫键连接的异三聚体蛋白。底物特异性和抑制剂实验的研究证明文昌鱼体液中酚氧化酶氧化O-diphenols(如Dopamine和4-methylcatecho1)的 活性较强，而氧化P-diphenol s(如Hydroquinone和Methylhydroquinone)的活性较弱；且苯硫脲能强烈抑制体液中酚氧化酶活性，而叠氮化钠对其活性抑制较弱；
由此推测文昌鱼体液中酚氧化酶可能是一种酪氨酸酶型。另外，利用抗体制备技 术制备了文昌鱼体液中酚氧化酶的多克隆抗体，并用western Blot对其进行了鉴 定，证明44、46和72 kDa三条带都能和抗体杂交。为研究酚氧化酶是否也参与文昌鱼的免疫反应，我们用大肠杆菌和溶藻胶弧 菌攻击文昌鱼，并对其攻击前后体液中的酚氧化酶的活性进行了检测，发现文昌 鱼被细菌攻击后，体液中酚氧化酶的活性显著增高。电泳和生化染色检测结果说 明诱导后文昌鱼体液中酚氧化酶活性的增加主要是三个亚基中的亚基2也就是46 kDa带的显著变化引起。这是首次关于文昌鱼免疫分子一酚氧化酶可以被微生物 诱导的报道。
最后，我们利用RT-PCR技术和RACE技术克隆出了文昌鱼的酚氧化酶基因(AmphiTYR)。AmphiTYR的cDNA序列为1048 bp，包含一个555 bp的开放阅读框，编码一个185氨基酸蛋白。其中包含一个铜离子结合保守位点(CuB)。这和无脊 椎动物酚氧化酶和脊椎动物酪氨酸酶都含有两个铜结合位点不同。序列相似性比 较分析结果显示，AmphiTYR鹏脊椎动物的酪氨酸酶和无脊椎动物酚氧化酶的相似 性分别为25-30[％]和10-15[％]左右。构建的进化树结果显示，文昌鱼的AmphiTYR 处于无脊椎动物的酚氧化酶和脊椎动物的酪氨酸酶之间。这与文昌鱼是连接无脊 椎动物和脊椎动物的桥梁，是无脊椎动物向脊椎动物转变的过渡类型一致。
文昌鱼;酚氧化酶;基因克隆
中国海洋大学
博士
海洋生物学
张士璀
2006
中文
Q959.287
153
2007-08-07（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）