大菱鲆腹水症病原菌的鉴定及其外膜蛋白的抗原性研究
大菱鲆(Scophthalmus maximus)自1992年引入我国以来，随着养殖规模的不断扩大，疾病的发生也日益突出，其中弧菌病成为制约大菱鲆养殖的关键因素。本研究从患腹水症的大菱鲆体内分离到一株病原菌，人工感染实验证实具有致病性，生理生化及分子生物学方法鉴定为溶藻弧菌(。Vibrio alginolyticus)。用该菌株免疫兔制备抗血清，间接免疫荧光抗体方法检测抗血清的特异性。用Sarkosyl法提取该菌株与主要水产弧菌及其它属细菌的主要外膜蛋白，SDS-PAGE和Western-blot方法分析主要外膜蛋白的结构组成及其抗原性。具体方法和结果如下：
2002年6月，山东省荣成地区发生大规模的大菱鲆幼鱼腹水症，病鱼症状为腹水、食欲下降、体表溃疡、眼球突出等，发病水温为16-17℃。本研究从患病鱼体腹水中分离纯化到的一株优势细菌SRl，利用SRl对健康大菱鲆幼鱼进行人工回接感染实验，确定该菌株SRl为大菱鲆腹水症的致病菌。经计算其半致死量LD<,50>为1.4×10<,6>CFU/尾，表明SRl为较强毒力的菌株。
菌株SRl经常规生理生化及APIID32E系统鉴定为溶藻弧菌。在此基础上，又对该菌株进行了分子生物学鉴定，测定了其16S rRNA基因序列和热激蛋白HSP60(Heat shock protein，HSP)基因序列。所扩增的16S rRNA基因序列长度为1 43l bp，在GenBank核苷酸序列数据库中的存取号为DQ269211，对菌株SRl16S rRNA基因序列进行同源性分析，结果表明菌株SRl与溶藻弧菌(AY967727)亲缘关系最近，然而置信度较低，仅有27[％]，不能有效地鉴定到种。为进一步确定其分类地位，测定了菌株SRl的HSP60基因，经PCR扩增，得到菌株SRl的HSP60基因部分序列长度为507bp，在GenBank核苷酸序列数据库中的存取号为：DQ269210。HSP60基因序列分析表明，该菌株与溶藻弧菌(AF230931)同源性最高，为99.2[％]。系统发育树表明SRL确与溶藻弧菌(AF230931)聚为一个分支，且置信度较高，为84[％]。综合上述结果，菌株SRl可鉴定为溶藻弧菌。
用菌株SRl的全菌免疫新西兰白兔，发现SRl能有效地刺激新西兰白兔产生免疫应答反应，产生抗血清。酶联免疫吸附法(ELISA)测得血清抗体效价为6 400。免疫荧光抗体技术(IFAT)检测表明该血清与菌株SRl发生特异性结合，与副溶血弧菌和哈维氏弧菌发生交叉反应,与非弧菌属细菌则没有交叉。用十二烷基肌氨酸钠(Sarkosyl)抽提结合超速离心纯化的方法提取了菌株SRl的主要外膜蛋白(major outer membrane proteins,MOMPs),通过SDS-PAGE分析其主要外膜蛋白的组成结构。结果表明,该溶藻弧菌的外膜蛋白带有12条,其中有9条主要蛋白带,分子量分别为106 kDa、73 kDa、66 kDa、51 kDa、48 kDa、45 kDa、39 kDa、36 kDa和32 kDa,另有3条不太明显的条带,分别为92 kDa、82 kDa和29 kDa;经SDS-PAGE后,外膜蛋白与兔抗SR1全菌血清的Western-blot印迹显示,12条蛋白带中有6条发生了免疫反应,分子量分别为73 kDa、48 kDa、45 kDa.、39 kDa、36 kDa和32 kDa,说明可能与溶藻弧菌SR.1抗原的特异性和致病性有关。
通过SDS-PAGE图谱分析比较了菌株SR1与5株弧菌标准菌株主要外膜蛋白的结构组成。结果表明,6株弧菌主要外膜蛋白的SDS-PAGE图谱各不相同,差异较大,但一般有6～12条蛋白条带,分子量多集中在106～65 kDa和48～28 kDa之间,其中分子量为48 kDa和36 kDa的蛋白条带为6株弧菌所共有。用兔抗SR1全菌血清进行Western-blot印迹显示,6株弧菌都能发生程度不等的阳性反应,反应条带的分子量集中在73～65 kDa、48～45 kDa和41～36 kDa之间,其中36 kDa的蛋白反应带为6株弧菌所共有。说明分子量36 kDa的外膜蛋白是这6株弧菌的共同抗原,有可能作为制备弧菌外膜蛋白亚单位疫苗的候选材料。
为进一步验证分子量为36 kDa的外膜蛋白是弧菌特异性的外膜蛋白,分析比较了菌株SR1及另外11株弧菌与爱德华氏菌、荧光假单胞菌和大肠杆菌的主要外膜蛋白组成结构。通过SDS-PAGE分析发现,36 kDa的外膜蛋白为这12株弧菌所共有,而爱德华氏菌、荧光假单胞菌和大肠杆菌的SDS-PAGE图谱则没有36 kDa的蛋白条带出现,说明36 kDa的外膜蛋白有可能是弧菌特异性的外膜蛋白,可作为弧菌属的标志,对于弧菌鉴定有一定的参考价值。
大菱鲆;腹水症;溶藻弧菌;致病性;HSP60基因;外膜蛋白;抗原性
中国海洋大学
硕士
水生生物学
周丽;战文斌
2006
中文
S941.4
68
2007-08-07（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）