海洋细菌Cellulophaga sp.QY201的卡拉胶酶研究
卡拉胶是一种红藻多糖，主要存在于红藻纲中的麒麟菜属、角叉菜属、杉藻属和沙菜属等生物的细胞壁中。卡拉胶是由1，3-β-D-吡喃半乳糖和1，4-a-D-吡喃半乳糖作为基本骨架，交替连接而成的硫酸线性多糖。目前能够工业化生产的主要有k-型、L一型和九-型三种卡拉胶，并已广泛应用于食品、化工等行业。近年来，人们发现不同聚合度的卡拉胶寡糖具有多种药理活性，有望发展为新一代的海洋药物。卡拉胶多糖的降解通常有酸水解和酶解两种方法，其中酶解反应条件温和、专一性强，己受到广泛关注。目前国内外对k-卡拉胶酶研究较多，而对τ一和λ-卡拉胶酶的研究报道很少。因此，高活性、高特异性的τ-和入-卡拉胶酶的发现具有重要理论意义和广阔应用前景。
本论文利用以卡拉胶作为唯一碳源的选择性培养基，从青岛近海筛选高产卡拉胶酶菌株。已发现298株产酶菌株，其中菌株QY201同其它菌株相比，具有酶活高、降解速度快、能同时分泌出K-、τ-、λ-卡拉胶酶等特点，因此我们以它作为研究对象进行了本课题的研究工作。
菌株QY201为革兰氏阴性菌，短杆状，可运动；菌落黄色，圆形，表面光滑，粘质。采用基于16S rDNA的分子系统学技术将菌株QY201鉴定为Cellulophaga属，命名为Cellulophaga spQY201。
经发酵条件优化确定最适培养基配方为(w／v)：3％NaCl，0．5％MgSO<,4>7H<,2>O，0.02％CaCl<,2>，0.01％KCI，0.002％FeSO<,4>0.25％CaSein，0.15％NaH<,2>PO<,4>，0.2％NaNO<,3>，0.25％τ一卡拉胶。固体培养基中τ一卡拉胶的终浓度为l％。最佳培养条件为25℃培养36h，优化后粗酶液的酶活最高可达2.64U／ml，较优化前提高了23倍。
我们进行了(?ellulophaga sp．QY201 τ一卡拉胶酶的分离纯化。发酵液经丙酮沉淀、离子交换层析、凝胶过滤层析，得到一种τ一卡拉胶酶，纯化倍数为30倍，比活力为60 U／mg，回收率为2％。纯化的-卡拉胶酶在SDS-PAGE中为单一条带，分子量为47.0 kD。酶反应最适pH为lO，在pH 6-8之间较稳定；最适反应温度为30℃，在O-30℃酶活力较稳定；Na<'+>。、K<'+>、Ca<'2+>、Fe<'2+>、Mg<'2+>、(NH<,4>)<,2>SO<,4>对酶活性有促进作用，Mn<'2+>、Ba<'2+>、Zn<'2+>、SDS以及EDTA对酶活性有抑制作用。该酶对τ-卡拉胶的：Km值为3.28 mmol/L。酶的底物专一性分析结果表明，该酶主要降解τ-卡拉胶，对K-卡拉胶、λ-卡拉胶、琼胶具有很微弱的降解作用，几乎不降解果胶、淀粉、褐藻胶。MALDI-TOF-MS分析表明，该酶降解τ-卡拉胶的最终产物主要为硫酸新τ-卡拉二糖。综上所述，本文从青岛海域筛选到一株高产K-、τ-和λ-卡拉胶酶的海洋细菌CelluIophaga sp·QY201，并从该菌株的发酵液中纯化到一种新的τ-卡拉胶酶。酶学性质研究表明该酶在碱性条件下活性很高，且降解τ-卡拉胶的最终产物主要为硫酸新τ-卡拉二糖，这些特性与迄今已知的τ-卡拉胶酶完全不同，在国际上属于首次报道。该酶的发现丰富了τ-卡拉胶酶的多样性，为其结构与功能研究的深入开展奠定了基础；同时为τ-卡拉寡糖的制备创造了条件，对推动海洋寡糖类创新药物的研究开发以及相关产业的发展具有重要的意义。
卡拉胶酶;海洋细菌;菌种鉴定;分离纯化
中国海洋大学
硕士
生药学
于文功
2006
中文
R282.77;R284.1
55
2007-08-07（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）