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DOI:10.7666/d.y989496

海洋细菌Pseudomonas sp.QDA algL、algG基因的研究

林育姿
中国海洋大学
引用
褐藻胶是由β-D-甘露糖醛(Mannuronate)和α-L-古罗糖醛酸(Guluronate)两种糖单元连续或交替连接而成的线性多糖分子。褐藻胶的用途非常广泛,结构不同的褐藻胶及其衍生物具有不同的生物活性,富含M的褐藻胶具有抗肿瘤、免疫调节剂等作用;而富含G的褐藻胶具有抗艾滋病等重要药用价值。因此,褐藻胶的生物合成以及降解、修饰等褐藻胶的生物转化已经成为该领域的研究热点。本论文以海洋Pseudomonas sp.QDA为研究对象,利用DNA重组技术对其褐藻胶裂解酶基因algL与甘露糖醛酸C-5差向异构酶基因algG挂行了研究。 Pseudomonas sp.QDA中褐藻胶裂解酶基因algl过量表达菌株的建立。首先,构建了过量表达载体pMF36-Ka-algL以及对照质粒pMF36-Ka,运用电击转化方法分别转入Pseudonmonas sp.QDA。通过卡那霉素抗性筛选以及PCR、酶切鉴定方法得到阳性克隆。胞外褐藻胶含量测定显示,褐藻胶裂解酶AlGL的过量表达对胞外褐藻胶产量没有明显影响,但在PAGE电泳中显示,裂解酶的过量表达使胞外褐藻胶分子量大幅度降低,形成一系列寡糖。这为褐藻胶寡糖的制备提供了新的方法。更重要的是,假单胞菌的胞外褐藻胶是生物膜形成的主要成分。细菌胞外褐藻胶可增强细菌的粘附性,促进生物被膜的形成;而细菌生物膜的形成是细菌产生耐药性和逃逸宿主免疫系统防御的主要原因。在algL过量表达的QDA菌株中,由于大分子褐藻胶被降解,从而阻止生物膜的形成。在eppendorf管造膜结晶紫染色实验中,生物膜量明显少于野生菌QDA。并且,在抑菌圈实验中,AlgL的过量表达使QDA对于相同抗生素的敏感性增强,特别是对于氨基糖甙类抗生素,抑菌圈明显增大。这些研究结果表明褐藻胶裂解酶与抗生素联用有望用于治疗细菌生物膜引起的慢性感染。 在生物体内褐藻胶的合成过程中,首先合成的是聚甘露糖醛酸段,在甘露糖醛酸C一5差向异构酶作用下部分甘露糖醛酸转变为古罗糖醛酸。目前检测甘露糖醛酸C-5差向异构酶活性的方法主要是确定其作用前后褐藻胶的M/G比,如NMR、高效液相色谱法、气相色谱法等。但这些方法存在耗时长、价格昂贵等问题。本文建立了一种简便快捷的甘露糖醛酸C-5差向异构酶活性的测定方法。我们发现相同分子量的聚甘露糖醛酸和聚古罗糖醛酸与苯酚硫酸试剂反应后显色程度不同。利用苯酚硫酸法测定了已知结构的褐藻胶片断的M/G比,其结果与传统的<'1>H—NMR测定值基本一致。因此,根据甘露糖醛酸C-5差向异构酶作用前后褐藻胶片段的吸光值差异可以计算甘露糖醛酸-5差向异构酶的活性。此方法简便有效,特别是对于大规模的产酶菌株筛选、酶促反应的条件优化等实验是十分适用的。在褐藻胶的生物合成过程中,甘露糖醛酸C-5差向异构酶决定了褐藻胶的M/G比,而不同M/G比的褐藻胶具有不同的生物活性。因此,甘露糖醛酸C-5差向异构酶结构和功能的研究有着重要的意义,近年来已成为本领域研究的热点。通过基因工程技术改造褐藻胶生产菌株的生物合成途径,或者直接利用重组酶,就可获得不同M/G比的褐藻胶。本文克隆了Pseudomonas sp.QDA的甘露糖醛酸C-5差向异构酶基因algG,构建了重组表达载体pET24a—algG,并转化宿主E.coliBL21,构建了生产该酶的工程菌。优化后的最佳产酶条件是诱导剂IPTG终浓度0.6mM,诱导温度为25℃,诱导时间为16小时。粗酶液的活性分析结果表明以多聚甘露糖醛酸或褐藻胶为底物该酶具有较高的活性。在30℃,反应18小时的条件下,可将底物终浓度为1mg/mL的聚甘露糖醛酸33%转变为古罗糖醛酸。目前,酶的分离纯化和性质分析正在进行。

褐藻胶裂解酶;甘露糖醛酸C-5差向异构酶;生物膜;海洋细菌

中国海洋大学

硕士

生药学

于文功

2006

中文

R282.77;R284.1

56

2007-08-07(万方平台首次上网日期,不代表论文的发表时间)