溶藻弧菌外膜蛋白DNA重组表达载体的构建及兔抗大黄鱼IgM血清制备
大黄鱼(Pseudosciaena Crocea)是我国单一品种养殖量最大的海水鱼类，被农业部确定为我国六种最具优势出口水产品之一。然而，随着人工养殖业的发展，养殖大黄鱼病害问题日趋严重，其中溶藻弧菌(vibrio alginolyticus)是养殖大黄鱼最常见的病原菌，给大黄鱼养殖业造成巨大的经济损失。病害防治事关大黄鱼养殖成败和可持续健康发展。DNA疫苗作为一种新兴的免疫防治手段，在最近几年内发展较快。DNA疫苗的免疫原性和免疫保护作用的有效性已经在大范围的动物模型试验中得到了证明，有着良好的应用前景。本文以大黄鱼为对象，构建了对大黄鱼养殖和人体健康构成严重威胁的溶藻弧菌的外膜蛋白W的真核表达重组DNA，同时制备了兔抗大黄鱼IgM抗血清，为进一步研究溶藻弧菌DNA疫苗奠定了良好的基础。具体内容如下：
分别用饱和硫酸铵二次盐析法和蛋白A亲和层析法对健康大黄鱼血清中的免疫球蛋白(IgM)进行分离纯化，所得产物用SDS-pAGE进行检测。结果表明：蛋白A亲和层析法可以较好地分离到高纯度的大黄鱼血清IgM，产物的电泳胶中只有重链和轻链2个条带；饱和硫酸铵二次盐析法除了有这2个条带，还有很多杂带，而且蛋白A亲和层析法更为简便、快速，因此用蛋白A亲和层析法分离纯化IgM优于饱和硫酸铵二次盐析法；大黄鱼免疫球蛋白重链的分予量在76kOat左右；轻链分子量在28kDa左右。用纯化的大黄鱼IgM免疫实验兔，获得效价高达1:40960的兔抗鱼IgM血清。本文所建立的蛋白A亲和层析法提取大黄鱼血清IgM可以方便、快捷地获得高纯度的产物，适合在实验室中纯化鱼类IgM。本研究所制备的兔抗大黄鱼IgM血清为今后的相关研究工作打下了坚实的基础。
细菌外膜蛋白被认为具有较强的抗原性，本文选定溶藻弧菌外膜蛋白w(GetleBarlk编号AY944132)为抗原基因设计引物，基因大小642个碱基，上游引物5’端加入HindⅢ酶切位点，下游引物5’端加入ECOV Ⅰ酶切位点。用PCR法克隆了溶藻弧菌外膜蛋白W基因，退火温度为45℃。经l％琼脂糖电泳检测，PCR产物长度与预期相符，测序检验发现PCR产物与溶藻弧菌外膜蛋白w基因序列的同源性为98％。以DcDNA3.1(+)为真核表达载体，与PCR产物分别进行双酶切后，以T4DNA连接酶进行连接，构建重组子。连接产物转化入大肠杆菌JM109，经氨卞青霉素筛选后，取阳性菌落提取质粒双酶切后，通过1％琼脂糖凝胶电泳检测证明插入片断大小正确，测序结果同源性为98％，至此成功构建溶藻弧菌外膜蛋白w的真核表达载体并命名为pcDNA3.1(+)-0mDw。
大黄鱼;DNA疫苗;溶藻弧菌外膜蛋白;蛋白A亲和层析法;血清制备
中国海洋大学
硕士
渔业资源
高天翔
2006
中文
S941.4
55
2007-08-07（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）