鳗弧菌胞外金属蛋白酶的纯化、修饰及毒性研究
鳗弧菌(Vibrio anguillarum)是引起水产动物疾病的重要的条件性病原，鳗弧菌的致病性与其分泌的胞外金属蛋白酶密切相关。本实验室从山东沿海发病海水鱼体中分离得到了鳗弧菌致病株CW-1和CW-4，对牙鲆和大菱鲆有较强的致病性。本论文进行了鳗弧菌胞外金属蛋白酶分离纯化、性质及致病性研究。
研究了环境因子对鳗弧菌CW-1和CW-4菌体生长及胞外蛋白酶分泌的影响，结果表明，鳗弧菌最适生长温度为28℃，在37℃时鳗弧菌的生长及胞外蛋白酶的分泌均受到显著的抑制：在28℃下，添加lmmol／LZn<'2+>和Cu<'2+>培养24h后，鳗弧菌CW-1的菌体生长及其胞外蛋白酶活力下降为83.25％和81．4％，鳗弧菌CW-4的菌体生长及胞外蛋白酶活力下降为71.71％和78.76％，0；添加Fe<'3+>、Ca<'2+>、Mg<'2+>则对鳗弧菌的生长以及酶活力没有显著影响；在培养基中添加葡萄糖、蔗糖、麦芽糖等不同碳源物质均能显著促进鳗弧菌的生长，其中以葡萄糖为最高，蔗糖和麦芽糖次之，当葡萄糖浓度为0.5％时，对菌体生长的促进作用最为明显，但添加不同碳源物质对于鳗弧菌胞外蛋白酶分泌均有抑制作用；氨苄青霉素对鳗弧菌的生长及其胞外蛋白酶的分泌有明显的抑制作用；添加金属螯合剂EDTA极显著抑制鳗弧菌的生长及其胞外蛋白酶的分泌，而EGTA对鳗弧菌的生长和胞外蛋白酶表达没有明显影响。
用硫酸铵盐析、DEAE—Sepharose Fast Flow和Sepharose 4B凝胶层析方法从鳗弧菌CW-1培养液中分离纯化了胞外蛋白酶，用SDS-PAGE电泳测得蛋白酶的分子量为65.3kDa，用Sephadex G-200凝胶过滤测得蛋白酶的分子量为65.6kDa，表明是一种单体蛋白。1mmol／L的PMSF。对酶活性无影响，EDTA能完全抑制酶的活性，表明该酶是一种金属蛋白酶。N-末端氨基酸序列为A E A T G T G P G G N Q K T G，与解蛋白弧菌(Vibrio poteolyticus)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、创伤弧菌(Vibriovulnificus)金属蛋白酶的N-末端序列有较高的相似性。
用DEPC、EDC、DTNB等8种化学修饰剂对鳗弧菌金属蛋白酶进行了化学修饰，结果表明化学修饰后酶的活力发生了改变，其中组氨酸、酸性氨基酸、半胱氨酸残基的化学修饰引起酶活性明显降低，说明组氨酸残基、酸性氨基酸、半胱氨酸残基及其二硫键在维持酶活力中发挥重要作用，是酶活力所必需;而对精氨酸、丝氨酸、ε-氨基等修饰后酶活性影响较小，表明不是酶的活性所必须的基团。
鳗弧菌CW-1金属蛋白酶对牙鲆鳃细胞系(FG)有细胞毒性作用，用1mg/mL金属蛋白酶作用于FG细胞，可以在12 h内观察到细胞死亡；通过测定组织培养液中牙鲆鳃细胞系(FG)线粒体脱氢酶(MDH)的释放量来确定金属蛋白酶对牙鲆鳃细胞的抑制率，0.01mg/mL的金属蛋白酶作用48h后对牙鲆鳃细胞系的抑制率为26.47％，1mg/mL时对其抑制率增加到72.5％，对牙鲆鳃细胞的半数抑制浓度(IC<,50>)为0.1181 mg/mL。金属蛋白酶对牙鲆鳃细胞超微结构的损伤主要表现为：细胞内初级溶酶体增加，粗面内质网和高尔基复合体增多，细胞核内染色质高度盘绕、凝聚、边缘化，细胞质中电子密度不均匀，随着作用时问延长，次级溶酶体数量增加，溶酶体内含物浓缩，电子密度逐步加大，可观察到溶酶体中聚积着难以消化的颗粒，并可以观察到凋亡小体的产生，有的细胞甚至出现崩解现象。
鳗弧菌;金属蛋白酶;环境因子;化学修饰;细胞毒性
中国海洋大学
硕士
生态学
陈吉祥
2006
中文
Q556.3;S945.19
69
2007-08-07（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）