氧化硫硫杆菌基因工程菌的构建及其葡萄糖代谢途径的研究
氧化硫硫杆菌是细菌冶金的一种重要细菌，是一种具有代表性的极端嗜酸性严格自养细菌，它能氧化元素硫和还原性的硫化合物，以CO<,2>作为主要碳源而生长，是一种严格好氧的专性自养化能无机营养细菌。
氧化硫硫杆菌缺乏EMP、ED途径以及TCA循环中的关键酶—磷酸果糖激酶、6-磷酸葡萄糖酸脱水酶、特征性酶2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸醛缩酶以及α-酮戊二酸脱氢酶等不能以有机质作为能源和碳源。只能通过固定CO<,2>获得碳源，从无机物的氧化获得能源，而无机物的氧化还原电位较高，可供这些细菌生长利用的能量很少，所以这类细菌往往生长缓慢，代时长，细胞得率低。这些因素直接影响了该菌的实际应用。这就需要用遗传学的方法改良这些菌种，使之适合于实际应用的要求。本研究的主要内容如下：
第一部分内容为利用接合转移的方法构建能够利用葡萄糖的氧化硫硫杆菌基因工程菌。pJRD215质粒载体及携带外源磷酸果糖激酶的重组质粒pSDK-1具有广泛寄主范围，可以在转移性质粒的诱动下进行转移。E.coli SM10菌株染色体上整合有RP4质粒的tra基因，也可推动含有mob位点的非转移性质粒进行接合转移。以SM10(pSDK-1)为供体菌，野生型氧化硫硫杆菌Tt-12作为受体菌进行了接合转移，获得了含有外源磷酸果糖激酶基因的氧化硫硫杆菌基因工程菌Tt-12(pSDK-1)。我们对质粒的稳定性进行了测定，结果表明，在无选择压力条件下连续传代50次，重组质粒pSDK-1在氧化硫硫杆菌Tt-12中的保存率仍可达到74％，说明质粒在氧化硫硫杆菌中比较稳定。对所构建的氧化硫硫杆菌基因工程菌在含有葡萄糖的Starkey-S°液体培养基中的生长状况以及工程菌对葡萄糖的利用情况等方面进行了研究。结果表明，对照野生型氧化硫硫杆菌菌株不能利用培养液中的葡萄糖进行生长，而氧化硫硫杆菌基因工程菌Tt-12(pSDK-1)却可利用葡萄糖，并随着葡萄糖浓度的增加其生长量逐渐增加。
为了研究外源基因的导入对氧化硫硫杆菌的一些主要代谢途径究竟有什么样的影响，我们采用<'13>CNMR及<'31>PNMR技术对葡萄糖在氧化硫硫杆菌基因工程菌中的代谢途径进行深入研究。<'31>PNMR检测结果表明，前期工作中构建的氧化硫硫杆菌基因工程菌Tt-12(pSDK-1)所携带的外源磷酸果糖激酶基因得到了表达，工程菌具有了磷酸果糖激酶活性。而没有携带外源磷酸果糖激酶基因的对照菌Tt-12(pJRD215)不具有磷酸果糖激酶活性。<'13>CNMR检测结果表明，在氧化硫硫杆菌基因工程菌Tt-12(pSDK-1)可同化葡萄糖形成部分细胞物质。氧化硫硫杆菌基因工程菌Tt-12(pSDK-1)主要通过EMP途径同化葡萄糖，并通过EMP途径生成3-磷酸甘油酸、磷酸烯醇式丙酮酸和丙酮酸等重要中间产物，这些中间产物是合成氨基酸的起始物。[1-<'13>C]-葡萄糖可经丙酮酸进入α-酮戊二酸，证明了氧化硫硫杆菌胞内存在丙酮酸脱氢酶体系，并具有柠檬酸合成酶、顺乌头酸酶以及异柠檬酸脱氢酶的活性，具有从丙酮酸反应生成α-酮戊二酸的完整途径。
氧化硫硫杆菌;接合转移;核磁共振;代谢途径;葡萄糖代谢
中国海洋大学
硕士
生态学
包振民;胡景杰
2006
中文
Q939.145;Q591.4
65
2007-08-07（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）