罗氏海盘车（Asterias Rollestoni）体壁胶原蛋白的分离纯化及其部分生物学功能的研究
罗氏海盘车是一种广泛分布于我国沿海地区的海星纲棘皮动物，其体壁中含有丰富的胶原蛋白。胶原蛋白作为细胞外基质中起支持作用的主要成分，具有“Gly-X-Y”的特异性氨基酸组成和螺旋结构，因其还具有抗原性低、可生物降解性强、生物相容性好等优点，故在生物学、医学、食品科学和美容业等领域中具有巨大的研究开发潜力和广阔的应用前景。
国内外对胶原蛋白的分离制备主要以哺乳动物皮肤、软骨以及鱼类皮肤等组织为原料，对其研究主要集中在分离制备和生物材料领域的开发应用方面。到目前为止，对棘皮动物胶原蛋白的研究仍比较少，而对罗氏海盘车体壁胶原蛋白的分离纯化及其生物学功能还未见报道。为了充分开发和利用我国沿海丰富的海盘车资源，建立罗氏海盘车体壁胶原蛋白的分离制备和纯化方法，查清其对体外培养的角膜细胞、皮肤细胞和肿瘤细胞的生物学功能，探索其在临床眼科、医学美容和肿瘤生物学应用的可能性，本文以罗氏海盘车体壁为原料，利用改良的酶解法分离纯化出了胶原蛋白，并用所得胶原蛋白纯化样品对体外培养的角膜细胞、皮肤细胞和肿瘤细胞进行了生物学功能研究，获得了较好的效果。为利用海盘车体壁胶原蛋白研制角膜组织工程支架材料、美容材料和抗肿瘤研究奠定了理论基础和技术条件，具有重要的科学意义和巨大的开发价值。
本文首先分别采用酸抽提法、中性盐抽提法和酶解法从罗氏海盘车体壁中提取胶原蛋白，通过将三种方法进行比较，发现酶解法提取结果明显高于酸抽提法和中性盐抽提法。所以，在对酶解法提取步骤进行了适当的改良后，将其作为最终抽提方法。所提胶原蛋白产物经凝胶柱纯化后，对该纯化样品进行生化性质的测定，并将其作为细胞培养添加物检测其对家兔角膜基质细胞(RCK)、新西兰大白兔角膜内皮(NCE)细胞、人胚胎皮肤成纤维细胞(ESF)和HeLa细胞的生物学功能。
生化性质的测定结果表明，所得胶原蛋白纯化样品由分子量分别为87.9kDa和84.OkDa的两种α链组成，产物中蛋白含量为97.5％，羟脯氨酸含量为9.75％，多糖含最为0.6％。
所得胶原蛋白纯品对体外培养角膜细胞的生物学功能实验结果显示：不同浓度的胶原蛋白作为角膜内皮和基质细胞培养液添加物均可不同程度提高细胞的贴壁速率和增殖速率，其中lmg／mL和10mg／mL浓度胶原蛋白促角膜细胞贴壁和促增殖作用明显。
胶原蛋白纯品对体外培养皮肤成纤维细胞的生物学功能实验结果显示，实验组中不同浓度胶原蛋白均可促进皮肤成纤维细胞贴壁速率，其中10mg／mL浓度和30mg／mL浓度胶原蛋白促皮肤成纤维细胞贴壁作用显著。不同浓度胶原蛋白对皮肤成纤维细胞增殖影响的实验结果显示，不同浓度胶原蛋白均不同程度促进皮肤成纤维细胞增殖速率，其中10mg／mL浓度胶原蛋白促皮肤成纤维细胞增殖作用显著。
胶原蛋白纯品对HeLa细胞生物学功能试验结果显示，不同浓度胶原蛋白均可促进HeLa细胞的贴壁速率和增殖速率，其中10mg／mL浓度和60mg／mL浓度胶原蛋白促HeLa细胞贴壁作用显著，10mg／mL浓度胶原蛋白促HeLa细胞增殖作用显著。
由以上结果可知，所提胶原蛋白纯品作为细胞培养添加物对细胞贴壁速率和增殖速率的促进作用与其添加浓度无明显正相关。
罗氏海盘车;胶原蛋白;角膜基质细胞;角膜内皮细胞;HeLa细胞;成纤维细胞
中国海洋大学
硕士
细胞生物学
樊廷俊
2006
中文
R284.2;Q512.6
60
2007-08-07（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）