三株具有抑菌作用的海洋细菌的鉴定及其胞外产物的研究
有益菌(probiotics)作为生物防治的手段应用于水产养殖体系中，用来改善养殖生态环境并取得了成效。人们在水产养殖中应用有益菌，将其既用作饲料添加剂来调节养殖动物肠道微生态平衡，又用于加入水体起控制养殖池微生物生态区系的作用，此外还用于改善养殖水体的水质条件。有益菌的应用可以调节和改善养殖环境微生态平衡，控制和减少养殖动物爆发性病害的发生，提高养殖动物的的免疫力，增强其抗病能力，因此成为国内外研究的热点。
本试验对从健康斑节对虾(Penaeus monodon)幼体分离的菌株L1及从养殖水体中防污附钢片的微生物粘膜中分离的菌株L2和L3，采用琼脂扩散法进行体外拮抗试验，测定其抑菌图谱。这三株海洋细菌均对鲈鱼病原鳗弧菌Wl(Vibrio anguillarum)表现出较强的抑菌作用。根据细菌形态和生理生化特征和16S rDNA序列分析，鉴定这三株海洋有益菌菌均属假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas)，其中 L1 是橙色假交替单胞菌(Pseudoalteromonas aurantia)，L2是Pseudoalteromonas piscfcida，L3与柠檬假交替单胞菌(Pseudoalteromonas citrea)的亲缘关系最近。
采用玻璃纸覆盖平板法制备菌株L1、L2和L3的胞外产物，优化培养条件，结果表明：菌株L1在28℃下培养48h、菌株L2在22℃下培养48 h、菌株L3在25℃下培养24h制备的胞外产物抑菌活性最高。对其胞外产物进行凝胶层析部分纯化后，进行温度、pH和蛋白酶K处理，结果表明热处理、酸碱处理和蛋白酶消化均可使其活性丧失，表明菌株L1、L2和L3的胞外活性物质含蛋白质。
从健康斑节对虾(Penaeus monodon)幼体分离的菌株LI及从养殖水体中防污附钢片的微生物粘膜中分离的菌株L2和L3，采用琼脂扩散法进行体外拮抗试验，测定其抑菌图谱。这三株海洋细菌均对鲈鱼病原鳗弧菌Wl表现出较强的抑菌作用。根据细菌形态、生理生化特征和16S rDNA序列分析，这三株海洋细菌均属假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas)，其中Ll是橙色假交替单胞菌(Pseudoalteromonas auranfia)，L2是杀鱼假交替单胞菌(Pseudoalteromonas Piscicida)， L3 与柠檬假交替单胞菌(Pseudoalteromnas citrea)的亲缘关系最近。
近年来病原性弧菌已成为经济鱼类、对虾、贝类死亡的重要原因之一<'[1-4]>为防治养殖动物的细菌性疾病，长期以来，人们主要依赖应用大量抗生素和各种化学药物。这虽然在一定程度上可抑制或杀死病原菌，但是其副作用也十分明显。一方面，可以增加细菌的耐药性，产生耐药性菌株<'[5,6]>；另一方面，可以破坏和干扰养殖环境中的正常微生物区系，导致微生态平衡失调口<'[7,8]>；另外，药物会在生物体内残留，给人类健康带来直接威胁<'[9]>。
为了改变这一状况，除了提倡良好的科学管理(如合理营养、改善水质、低放养密度等)以及使用疫苗外，生物防治(即利用微生物治理微生物，用微生物治理环境，改善养殖动物的生活环境，提高动物的非特异性免疫力，从而促进养殖动物健康生长)的方法，引起国内外学者的共同关注，已成为一个新的研究热点<'[1,ll,26]>处于同一生态系统中的不同菌群在其生态位竞争中采用不同的策略。许多细菌和其他微生物可在环境中分泌抗生素，能很快杀死其他微生物<'[12]>；有的细菌产生细菌素<'[13]>，可杀死与其亲缘关系相近的种；也有的在生态系统中是优势菌，是营养竞争的胜利者，使他们在自然环境中占有生存优势。近年来，人们已经开始将微生物的这些相互作用方式应用到水产养殖中，并取得了成效<'[14]>。
采用玻璃纸覆盖平板法制备菌株L1、L2和L3的胞外产物,优化培养条件,结果表明:菌株L1在28℃下培养48 h、菌株L2在22℃下培养48 h、菌株L3在25℃下培养24 h制备的胞外产物抑菌活性最高。对其胞外产物进行凝胶层析部分纯化后,进行温度、pH和蛋白酶K处理,结果表明热处理、酸碱处理和蛋白酶消化均可使其活性丧失,可见菌株L1、L2和L3的胞外活性物质含蛋白质。
假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas)的细菌是较为常见的专性海洋细菌,广泛分布于海洋环境中。从进化关系上,假交替单胞菌属源于交替单胞菌属(Alteromonas)。修订后的交替单胞菌属现只保留了一个物种A-macleodii,其它的物种则都归新属假交替单胞菌属<'[1,2]>。假交替单胞菌属的细菌是能产生抑菌活性物质的种属之一<'[3]>。Gauthier和Flateau<'[4]>从海藻的细菌区系中分离到一株藤黄交替单胞菌(Alteromonas luteovilaceus),可产生一种具有抑菌活性的聚阴离子多糖。Lemos等<'[5]>报道从潮间带藻类上分离到的假交替单胞菌属的海洋细菌,可产生小分子量的抑菌活性物质。shiozawa<'[6]>等报道一株交替单胞菌可产生有抗菌作用的Thiomarinol。Riquelme等<'[7]>从扇贝中分离到一株河豚毒素单胞菌(Alteromonas haloplanktis)对病原弧菌有拮抗作用。另外,Ruiz等<'[8]>从扇贝上也分离到具有抑菌活性的假交替单胞菌。Holmstr m等<'[9]>报道P.tunicate的胞外抑菌活性物质至少有5种:有专门抑制无脊椎动物幼虫的耐热的极性小分子,大小约500 Da;有分子量3-10 kDa的专抑制海藻生长的热敏感极性物质;有专性抑制细菌的大分子蛋白,分子量为190 kDa,该抑菌蛋白有广泛的抑菌图谱,陆地和海洋环境的大部分革兰氏阳性和阴性细菌均可抑制。Isnansetyo等<'[10]>报道P.phenolyca产生的抑菌物质可以抑制盘尼西林抗性菌Staphlylococcus auFeus的生长。
海洋有益菌;抑菌活性;假交替单胞菌属;胞外产物;蛋白质;病原性弧菌
中国海洋大学
硕士
细胞生物学
李筠
2006
中文
Q939.1
64
2007-08-07（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）