黄酮与过氧化氢对人角膜内皮细胞凋亡的作用研究及黄酮抗氧化分子机理初探
近年来的研究表明，细胞凋亡与许多疾病的发生有着极其密切的关系，许多角膜病均是由活性氧导致角膜内皮细胞凋亡所引起的。目前对活性氧诱导人角膜内皮细胞(HCECs)凋亡的研究主要是通过临床实验进行的，耗资大且耗时多，在很大程度上限制了角膜病研究的范围及进程。本文以人角膜内皮细胞系为材料，采用细胞形态观察、吖啶橙／溴化乙锭双染色、DNA电泳及酶联免疫吸附测定(ELISA)等实验技术手段，在体外对过氧化氢(H<,2>O<,2>)和黄酮对HCECs凋亡的影响及黄酮抗氧化的分子机理进行了初步研究，以期为HCECs凋亡所致角膜病的临床治疗提供理论依据。
不同浓度H<,2>O<,2>对体外培养HCECs作用的研究结果显示，经200—800μ mol／L H<,2>O<,2>处理的HCECs在形态学、吖啶橙／溴化乙锭双染色及DNA电泳检测中均不同程度地表现出凋亡特征，且HCECs的凋亡程度与H<,2>O<,2>的浓度和作用时间呈明显的正相关性。浓度为800μmol／L的H<,2>O<,2>作用10h后，HCECs的凋亡程度极为显著。经检测，凋亡HCECs的DNA在琼脂糖凝胶电泳中出现了明显的梯状条带。
不同浓度黄酮对体外培养HCECs作用的实验结果发现，黄酮在浓度为55和70μmol／L时，不能引起HCECs凋亡，而在85和100μ mol／L的浓度下能诱导HCEs凋亡，在此浓度范围内，凋亡程度与黄酮的浓度和作用时间呈正相关性。浓度为85μmol／L的黄酮作用8h后，HCECs的凋亡程度非常显著；经检测，凋亡HCECs的DNA出现了断片化。
黄酮预处理对H<,2>O<,2>引起的HCECs凋亡的影响作用结果表明，55和70μ mol／L黄酮的预处理对600μmol／L H<,2>O<,2>引起的HCECs凋亡具有显著的抑制作用，而85和100μmOl／L黄酮的预处理则不能抑制H<,2>O<,2>引起的HCECs凋亡。其中，70μ mol／L黄酮预处理对H<,2>O<,2>引起的HCECs凋亡的抑制作用非常显著，HCECs的DNA没有出现断片化。可见，黄酮在大约70μmol／L的较低浓度下对HCECs有强烈的抗氧化保护作用，而在高浓度下则没有抗氧化作用。
为了初步查清黄酮抑制H<,2>O<,2>引起HCECs凋亡的分子途径及其作用机理，本文利用凋亡诱导因子(AIF)及细胞色素c(Cyt.c)的单克隆抗体，对H<,2>O<,2>或／和黄酮处理前后HCECs中AIF与cyt．c浓度的变化进行了ELISA检测。研究结果表明，经600 μ mol／L H<,2>O<,2>处理的 HCECs，其AIF的浓度及胞质中Cyt．c的浓度与未处理对照组相比均有不同程度的升高。AIF的浓度在处理6h之前随着处理时间的延长而升高，在处理6h时升高了近0.3倍，之后又随着处理时间的延长而略有降低；Cyt．c的浓度在处理3h之前即显著升高，处理3h时升高了6.85倍，随后便逐渐降低。经70μmol／L黄酮处理的HCECs，其AIF的浓度及胞质中cyt．c的浓度与对照组相比均没有显著差异。而70 μ mol／L黄酮预处理后再用600 μ mol/L H<,2>O<,2>处理的HCECs，其AIF浓度及Cyt．c浓度与未处理对照组相比也没有显著差异。说明H<,2>O<,2>所引起的HCECs细胞凋亡与Cyt．c及AIF的浓度升高有关，且黄酮能抑制由H<,2>O<,2>引起的cyt．c及AIF浓度的升高。由此可见，黄酮对由H<,2>O<,2>所引起HCECs细胞凋亡的抑制作用，即黄酮的抗氧化作用，很可能是通过抑制线粒体通透性的增大进而阻止AIF和Cyt.c的外流而实现的。
本文利用在体外所建立的HCECs凋亡研究的理想实验体系，查清了H<,2>O<,2>和黄酮对 HcEcs凋亡的影响作用，并初步查清了黄酮的抗氧化分子机理，不仅为HCECs凋亡所致角膜病的发病机理研究奠定了理论基础，对于早日揭示人角膜内皮细胞凋亡的细胞与分子机理及其调控机制具有重大的科学意义，而且对于早日攻克HCECs凋亡所致角膜病、实现其临床治疗还具有重要的推动作用。
角膜内皮细胞;细胞凋亡;过氧化氢;黄酮;凋亡诱导因子;细胞色素c;抗氧化分子
中国海洋大学
硕士
遗传学
樊廷俊
2006
中文
R772.2;R965.2
62
2007-08-07（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）