单环刺螠（Urechis unicinctus）vasa基因及β-actin基因的克隆与表达分析
vasa基因编码DEAD-box家族成员中一种ATP依赖的RNA解旋酶，在果蝇中作为生殖质的组成成份被首次报道。vasa基因可在许多后生动物生殖系细胞中特异性的表达，因此被广泛用作生殖细胞的分子标记物，在动物生殖细胞发生和生殖调控等研究中起到了重要的作用。单环刺蜢(Urechis unicinctus)属蜢虫动物门(Echiuroidea)，是我国黄渤海沿岸常见的刺蜢物种。本文采用同源克隆策略及SMART-RACE技术，筛选和克隆了单环刺<虫益>vasa基因的全长cDNA序列，并利用半定量RT-PCR技术对其组织分布及发育过程的表达变化进行了分析，以期为进一步研究单环刺<虫益>原生殖细胞的起源、分化及其生殖调控奠定基础。
本研究获得的单环刺<虫益>vasa基因的cDNA序列全长4080bp，其中开放阅读框ORF长2322bp，可以编码773个氨基酸的蛋白，5′UTR(Untranslated Reagion，非编码区)为322bp，3′UTR为1436bp。Blastp分析表明由该cDNA推导的氨基酸序列与哺乳动物、鱼、两栖类、昆虫以及一些无脊椎动物的VASA蛋白序列均具有较高的相似性；除具有DEAD-box家族蛋白共有的全部8个保守motif晓外，在其N端还具有RGG重复序列及甘氨酸富集区等vasa亚家族基因的专一性特征结构；进一步的系统进化分析结果也显示由该cDNA推导的蛋白序列和其他物种的VASA相关蛋白聚成一支，其与VASA亚家族成员的进化关系明显近于PL10或是P68等其他DEAD-box亚家族蛋白，表明获得的为单环刺蜢的vasa基因的全长cDNA序列，并将其编码的蛋白命名为UuVASA。采用半定量RT-PCR技术研究了单环刺蜢vasa mRNA在不同组织中的分布，发现在两性生殖细胞中vasa基因均存在较高水平的表达，但在其他组织(非生殖期成体的体壁、中肠、呼吸肠、肾管及体腔液细胞)中则几乎检测不到其表达信号，表明在单环刺蜢体内，vasa基因同样仅限制在生殖系细胞中表达，因此可以作为一个分子标记来追踪单环刺<虫益>PGCs的起源、迁移和分化；对其各个发育阶段表达的RT-PCR结果显示，在卵母细胞及受精卵中均存在vasa mRNA的表达信号，因此认为单环刺（虫益）（打不出来）早期胚胎中vasa基因的表达是由母源性提供的；从受精卵至8-细胞期其表达呈明显增强趋势，表明受精后启动了vasa的合子表达；囊胚期的表达有所减弱，到担轮幼虫期其表达量极其微弱，之后又逐渐增强，表明担轮幼虫之后vasa基因主要由合子表达提供，其表达趋势与其他大多数物种的vasa基因相类似。此外，选择性拼接的实验结果中并未发现预期的拼接突变的条带，因而初步推测单环刺（虫益）（打不出来）vasa基因不存在N末端选择性拼接的情况。β-actin因其高度保守的特征及持续衡量表达的特点，常作为许多量化实验的内参照，并且其氨基酸序列被广泛用于构建真核生物分子发生树以反映物种间的进化关系。本研究中获得的单环刺（虫益）（打不出来）β-actin基因的eDNA序列全长1527bp，其中开放阅读框ORF长1131bp，可编码376个氨基酸；5＇UTR为82bp，3＇UTR为314bp。Blastp分析显示由该cDNA推导的蛋白质与哺乳动物、两栖类、鱼、昆虫以及贻贝、海星等无脊椎动物的I~-acfin蛋白序列存在很高的相似性，相似度均在95％以上，表明其在生物进化过程中保持着高度的保守性；进一步的系统进化分析也发现，单环刺（虫益）（打不出来）β-actin与所有选择物种的β-actin聚类，表明获得的为单环刺（虫益）（打不出来）β-actin基因的全长eDNA序列，同时系统进化树显示其系统发育关系与传统的分类关系基本一致，因此认为β-actin可以作为生物物种进化的分子标志，能够比较正确的反映物种间的系统发生关系。
单环刺螠;vasa基因;DEAD-box;生殖细胞;同源克隆;SMART-RACE;半定量RT-PCR;系统进化分析;β-actin基因
中国海洋大学
硕士
细胞生物学
张志峰
2006
中文
Q78
70
2007-08-07（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）