高温胁迫和鳗弧菌感染对栉孔扇贝基因表达影响的分析及相关基因的克隆与表达
本研究采用mRNA差异显示技术分析了高温胁迫和鳗弧菌感染对栉孔扇贝基因表达的影响。克隆了栉孔扇贝色氨酸双加氧酶(TDO)，HSP70和肌球蛋白基因，并进行了表达分析。
采用3条锚定引物和8条随机引物组成24对引物组合，对高温胁迫前后栉孔扇贝基因表达变化进行了mRNA差异显示分析。在2599条扩增条带中，有59条差异条带，其中，9条在胁迫样本中特异扩增，20条只在对照样本中扩增，13条在胁迫样本中高水平扩增，17条在胁迫样本中低水平扩增。三种锚定引物H-T11A，H-T11C，H-T11G的扩增条带总数分别为867条，865条和867条，而差异条带数占相应锚定引物总扩增条带数的比例分别为1.61％，1.84％和3.34％，特异条带数占相应锚定引物总扩增条带数的比例分别是：0.58％，0.81％和1.96％，H-T11G均明显高于H-T11A和H-T11C。
同样利用mRNA差异显示技术，采用24对引物组合，分析了鳗弧菌应激前后栉孔扇贝基因表达的变化。共扩增得到2047条扩增条带，其中差异条带为32条。6条条带在胁迫样本中特异扩增，2条只在对照样本中扩增，9条在胁迫样本中高水平扩增，15条在胁迫样本中低水平扩增。三种锚定引物H-T11A，H-T11C，H-T11G的扩增条带总数分别为755条，613条和679条，而差异条带数占相应锚定引物总扩增条带数的比例分别为1.10％，1.79％和1.91％。特异条带数占相应锚定引物总扩增条带数的比例分别是：0.26％，0.33％和0.59％，H-T11G均高于H-T11A和H-T11C。
克隆了在鳗弧菌应激条件下，表达量减少的TDO基因片断，并利用5'RACE技术得到了基因全长。栉孔扇贝TDO基因全长1292bp，编码383个氨基酸，分子量为44.8KD，等电点为6.35。编码的氨基酸序列与果蝇、人、斑马鱼、小鼠和线虫TDO的相似性分别为61％，57％，56％，55％和54％，并含有可能与TDO酶活性有关的保守性组氨酸。在大肠杆菌中表达了TDO-GST融合蛋白，并用融合蛋白制备了多克隆抗体。RT-PCR及Westernblotting结果表明，栉孔扇贝TDO在鳃、消化腺、外套膜、闭壳肌、肾和性腺中都有表达。免疫组化分析显示，TDO在几乎所有细胞的胞质中都有表达。
获得了栉孔扇贝HSP70基因的DNA序列和cDNA序列。该基因DNA序列全长4368bp，与牡蛎Hsc70基因结构相似，都由6个外显子和5个内含子组成。但内含子的长度比牡蛎Hsc70基因内含子长。每个内含子的两端都有RNA正确剪切所必需的识别位点GT/AT。编码的氨基酸序列含有HSP70家族的特征序列。RT-PCR分析表明HSP70在栉孔扇贝鳃、消化腺、外套膜、闭壳肌、肾和性腺中都有表达。利用非变性丙稀酰胺凝胶电泳和WAVE系统分析，找到了HSP70基因3'UTR中的一些个体内插入缺失和点突变位点。通过分析三个群体(长岛野生群体、长岛选育一代群体及长岛选育二代群体)和长岛野生群体不同耐热能力个体中HSP70基因3'UTR多态性，找到了可能与抗逆性状有关的位点。利用兼并引物RT-PCR扩增栉孔扇贝外套膜肌球蛋白基因，得到一个143bpcDNA片断，编码47个氨基酸的肌球蛋白VI基因片断。分别利用5'RACE和3'RACE克隆肌球蛋白的5'端和3'端序列，拼接后得到长度为2940bp，含有2835bp开放阅读框，编码945个氨基酸的肌球蛋白VI部分基因。编码的氨基酸具有肌球蛋白家族的保守序列和肌球蛋白VI的特征序列，与鸡、人和果蝇肌球蛋白VI的相似性分别为60％，59％和56％，表明得到的基因片断编码栉孔扇贝肌球蛋白。RT-PCR分析表明肌球蛋白VI在栉孔扇贝鳃、消化腺、外套膜、闭壳肌、肾和性腺中都有表达，在肾和性腺中的表达量高于其它组织。在大肠杆菌中表达了肌球蛋白VI-GST融合蛋白。
栉孔扇贝;色氨酸双加氧酶;肌球蛋白VI;高温胁迫;鳗弧菌感染;基因表达;基因克隆;海洋生物学
中国海洋大学
博士
海洋生物学
包振民
2005
中文
S944.43;S985.36;Q344.13
144
2006-07-27（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）