对虾白斑症病毒快速检测试剂盒的研制及其应用
目前，白斑症病毒(whitespotsyndromevirusWSSV)严重影响虾的养殖，由于目前没有有效的药物治疗，因而，快速方便的检测方法势在必行，以期早发现，早预防。本论文进行的白斑症病毒快速检测试剂盒的研制及其应用，正是迎合此需要。
本论文是从本实验室原有的抗WSSV单克隆抗体库和本次实验制备的12株分泌抗WSSV单抗的细胞株中，采用间接荧光检测法，筛选出8株分泌较强的抗WSSV单抗的细胞株，将此细胞株通过制备腹水，扩增得到高效价的抗WSSV单抗，并将其纯化，用于白斑症病毒快速检测试剂盒的研制。
白斑症病毒快速检测试剂盒的研制，是用斑点免疫金渗滤法检测白斑症病毒。将WSSV包被在硝酸纤维膜上，通过标有红色胶体金的抗WSSV单抗经硝酸纤维膜渗滤，使抗原与抗体在膜上快速反应，从而标在抗WSSV单抗上的红色胶体金在膜上堆积、显色，来检测样品中的WSSV。本论文对以上8种从腹水中纯化得到的抗WSSV单抗，采用斑点免疫印迹法测其效价；采用Western-blot分析WSSV单克隆抗体的类型；采用免疫电镜对抗WSSV单抗作用的抗原决定簇分析。通过对这8种单抗效价、抗体类型、抗原决定簇的分析，选出效价较高、抗体类型属IgG、抗原决定簇在病毒囊膜上的单抗3B7，2E6、4G9为金标抗体。实验中发现WSSV囊膜极易破碎，为增强检测的灵敏度，因而将抗原决定簇在病毒核衣壳上的单抗2A3也选为金标抗体，通过不同检测模式的比较，得出最佳金标抗体为金标2E6和金标2A3等比混合液。并采用系列实验对试剂盒检测程序中的各项条件进行优化，使整个反应只需3分钟，并且不需要孵育及任何仪器设备。肉眼可见的红色斑点表示WSSV阳性。此法与斑点免疫印迹法比较，其灵敏度两者相同。但此法更为快速、方便、简单、现场、准确，并且无假阳性。
白斑症病毒现场检测试纸条的研制，是用一步免疫胶体金层析法检测白斑症病毒。用红色的胶体金标记抗WSSV的单抗2E6和2A3，通过不同模式的对比，选出抗WSSV的单抗4G9为最佳包被抗体，并将其包被在硝酸纤维膜上，采用双抗夹心免疫层析法，制成快速检测、诊断WSSV的试纸条。整个反应只需5分钟，并且不需要孵育和任何仪器设备。硝酸纤维膜上检测线处显示肉眼可见的红色线条表示WSSV阳性。与斑点免疫印迹法进行比较，两者的检测灵敏度相同。因而，白斑症病毒现场检测试纸条是一种快速、简便、准确、适合于现场使用的WSSV检测、诊断试纸条，并且无假阳性。此试纸条尤其方便养殖人员现场、时事跟踪监控、检测，为白斑症的预防提供可靠监测依据。
以上白斑症病毒快速检测试剂盒和白斑症病毒现场检测试纸条由于用胶体金代替酶标记在用于检测的抗体上，因而，避免了酶联免疫检测法因内源酶干扰导致的假阳性。将渗滤与层析原理用于检测中，使检测速度缩减到5分钟内出结果。与以往检测WSSV较快的斑点免疫印迹法的3小时相比，则很大程度上提高了检测速度。
同时，我们在白斑症病毒快速检测试剂盒和白斑症病毒现场检测试纸条的研制，为白斑症的监控了提供可靠的监测依据的基础上，对白斑症病毒感染与病毒囊膜完整性的关系进行了探讨，为深入研究如何切断WSSV感染途径，为白斑症的预防提供一条新思路、新方法积累实验依据。
本论文实验中，利用物理低渗方法即用蒸馏水使WSSV的囊膜全部破碎，破坏了病毒囊膜完整性，用此病毒做螯虾体内、外感染实验，结果发现WSSV的囊膜完全破碎后仍具有感染性。在此基础上，分别用抗WSSV囊膜的单抗4G9和抗WSSV核衣壳单抗2A3进行螯虾体内中和实验，结果显示抗WSSV囊膜的单抗有中和作用，而抗WSSV核衣壳单抗无中和作用。将破碎的囊膜从核衣壳上去掉后，用不同浓度的纯核衣壳重复以上体内感染实验，结果其感染性消失，说明囊膜破碎的WSSV引起的感染是由WSSV上的破碎囊膜介导的病毒侵染所致，而不是核衣壳被直接内吞引起的。这些结果提示WSSV是否引起靶细胞感染，主要与病毒囊膜上与病毒侵染有关的功能蛋白的量和活性有直接关系，只要这些功能蛋白活性不变并且存在的量足以与靶细胞膜结合，即使WSSV囊膜破碎、结构不完整也能引起感染，这可能是WSSV多年来一直肆虐、难以控制传播的主要原因之一。
斑点免疫金渗滤法;免疫胶体金层析技术;单克隆抗体;对虾;白斑症病毒;虾养殖
中国海洋大学
博士
水产养殖
战文斌
2005
中文
R758.41;S968.22
94
2006-07-27（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）