强制渗透法制备水溶性壳聚糖及其固定化酶解方法与产物研究
水溶性壳聚糖广泛应用于医药、食品、化工、环境等行业，其制备方法仍是当今普遍研究的热门课题。本文提出了利用强制渗透法与酶法联合制备大分子水溶性壳聚糖的一种简便、快速、高效且切实可行的新方法，并对水溶性壳聚糖进行了特性分析。具体内容如下：
1.利用强制渗透法制备水溶性壳聚糖并对其溶解性机理进行了研究。结果表明脱乙酰度在50％左右的壳聚糖溶液在中性pH条件下溶液澄清透明，在碱性条件下处于半透明状态。电镜扫描(SEM)结果表明在真空条件下将浓碱强制渗透于甲壳质颗粒的微孔中有利于加速甲壳素的溶胀以及NaOH的传质过程，达到近似均相的脱乙酰状态。通过特性粘度、粉末X-射线衍射、FT-IR、1H-NMR、溶解性测定等结果表明，在此条件下的分子结构松散，分子间力较弱，有利于水分子引入大分子结构中并发生氢键键合而溶解。适当降低分子量可降低分子间作用力，提高其溶解度。
2.对壳聚糖大分子的酶法降解相对其它化学降解具有条件温和、易控制、分子结构不易被破坏等优势。本文利用果胶酶和纤维素酶对壳聚糖的水解活性进行比较并对适合于水解该壳聚糖的酶进行固定化。
2.1在比较之前，分别对壳聚糖的脱乙酰度、酶解产物的分析方法进行了研究。结果表明粉末X-射线衍射可用于测定甲壳质和壳聚糖的脱乙酰度，利用果胶酶或纤维素酶降解法也可测定壳聚糖的脱乙酰度。
2.2酶解产物的分析方法采用检测浓度范围宽、操作简便、便于高通量测定的DNS法，并对该方法进行了优化，通过化学计量学分析确定了检测波长为500nm。此处波长灵敏度比通常采用的540nm高，而背景干扰相对其最大吸收波长480nm左右要小。另外，由于氨基葡萄糖和N-乙酰氨基葡萄糖的吸光系数不同，只适用于相同脱乙酰度条件下的活性比较。因此，酶对不同脱乙酰度壳聚糖水解活性的影响需标准曲线的参数校正或直接采用粘度降低法进行比较。
通过对酶解过程特性粘度降低情况进行比较，结果发现果胶酶对脱乙酰度60％左右的壳聚糖水解活性最高，而纤维素酶对高脱乙酰度壳聚糖水解活性较高，对低脱乙酰只显示较低活性。结果表明果胶酶更适合于水解半脱乙酰壳聚糖。另外，由于过多的乙酰基会造成空间位阻，反而不利于果胶酶的水解，特别是在异相条件下对低脱乙酰度壳聚糖的水解，因此，有希望以甲壳素为载体进行果胶酶的固定化。
2.3本文分别采用甲壳素和Eupergit为载体分别对果胶酶进行固定化研究。结果表明，以甲壳素为载体所得到的尽管固定化果胶酶活力回收较高，但由于甲壳素刚性不足，在柱式反应中存在缩柱现象而不如Eupergit载体更适合于连续化生产。通过以Eupergit为载体对果胶酶的固定化方法优化，根据其活力回收、稳定性比较发现：在pH为6.0，浓度为1.25mol/L的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液中，以1mg果胶酶蛋白/g载体的比例，固定化效果最好。
3.本文利用pH结合醇沉法对固定化酶解产物进行了不同分子量段的组分分离，并以非酶解半脱乙酰度壳聚糖的分离为对照，结果表明溶解度随分子量段减小而水溶性增大，通过粉末X-射线衍射及FT-IR，1HNMR分析表明，水解过程中脱乙酰度基本无变化，分子结构逐渐无序化，大分子的特征峰消失或几乎消失。通过进行壳聚糖对血管紧张素转移酶(ACE)的抑制活性的初步研究，发现低脱以酰度壳聚糖对ACE的抑制活性不如对高脱乙酰度壳聚糖的抑制活性强。
总之，采用强制渗透法对甲壳素进行均相脱乙酰化，所得水溶性壳聚糖为大分子壳聚糖，分子量在180kD以上，操作简便、耗时短、成本低廉，便于工业化应用。另外，用果胶酶或固定化果胶酶对该壳聚糖进行进一步水解的方法是切实可行的，通过对组分特性分析表明半脱乙酰度壳聚糖的溶解度大小取决于其分子量的大小。
壳聚糖;甲壳素;水溶性;脱乙酰度;酶固定化
中国海洋大学
博士
水产品加工与贮藏工程
薛长湖
2005
中文
O636.1;Q55
124
2006-07-27（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）