西北太平洋深海沉积物微生物多态性分析
利用分子生物学的方法来研究微生物生态，DNA质量起着十分重要的作用。其中包括：一DNA量的多少、二DNA的完整性、三所提DNA是否能代表微生物的种群多样性。1)本研究通过比较Zhou，Bath，Microwave及PVP等四种方法对DNA提取的影响表明：从DNA条带的强弱上来看，Bath法最不适合深海沉积物DNA的提取，Zhou法和Microwave法提取DNA量最多；从DNA完整性上来看，Zhou法最适合于深海微生物DNA的提取。2)利用紫外分光光度计对提取的DNA进行回收效率的检测发现，柱子法和电泳法的回收效率均低于25％，但柱子法回收效率较电泳法高。3)DGGE条带可以反映所检测样品的微生物种群数量多少。以三种提取方法和两种回收方法得到的DNA为模板，两组DGGE引物进行种群多样性比较表明，用Zhou法提取、柱子法回收的DNA得到了最多的DGGE带谱；同时610bp的片段可以获得较210bp片段更多的谱带。
通过研究PCR反应条件对分子生物学方法检测微生物种群多态性的影响可见：1)高GC含量的模板不利于PCR扩增，但错配是造成PCR偏好性的决定性因素。2)退火温度升高会加剧因GC百分含量不同及错配造成的偏好；而低于47℃的退火温度可以有效的降低这两种因素引起的偏好。3)改变循环数不会有效的减小PCR偏好。同时，研究还表明，PCR产物中的条带代表的是群体中占有优势的物种。
利用提取纯化的样品总DNA为模板，扩增了细菌和古菌16SrDNA片段，并构建了相应文库。通过对文库克隆子的ARDRA分析，探讨了文库OTU多样性，结果表明：1)对细菌而言，EcoRI的酶切图谱条带数为1-3条，共分为11个带型；RsaI酶切图谱的条带数多为1-6条，其中以3-4条居多。文库多样性分析表明，文库覆盖率为59-76％，且以SH5的覆盖率最低。样品F120401与F120614有最低的相似性指数；与SH5有最高的相似性指数。2)对于古菌，构建了SH4和SH5的16SrDNA文库，大部分(＞80％)克隆子外源片段不能用EcoRI酶切，RsaI酶切带型复杂，表现出较细菌更为复杂的种群多样性。文库多样性分析表明，两文库多样性覆盖率为47-60％。
通过ARDRA分析，各文库挑选部分克隆子进行测序，后据GenBank中的相似性序列构建系统发生树，结果表明：1)对细菌而言，各样品微生物种群主要分属于四大类：变形细菌(朊细菌，Protecobacteria)、浮游霉菌(Planctomycetes)、酸杆菌(Acidobacte)和绿屈挠菌(Chloroflexi)。其中以变形细菌为主，包含其四个亚类：alpha、belta、gamma及delta。2)对古菌，测序克隆子有半数属于嗜泉古菌(crenarchaeote)，其它的属于未能鉴定或培养的古菌。本试验通过同源性分析发现了沉积物样品中包含有硫氧化细菌，硫酸盐还原菌，甲烷营养细菌，及甲烷营养占菌，但未发现与产甲烷古菌同源的古菌。并在前人研究的基础上，提出了深海沉积物C、S代谢模型。
选用能够代表深海沉积物种群多样性的27个单克隆，扩增其不同长度的16SrDNA片段做DGGE分析，结果表明：610bp片段的分离效果较210bp片段好。同时，在利用总DNA对16SrDNA的扩增过程中，前者扩增条带数目要多于后者扩增的条带数目，含有更多的信息量。
利用610bp片段对五个深海沉积物样品进行DGGE分析表明，五样品共同具有部分优势微生物种群，且这些种群在各样品中有数量上的变化或差异。与ARDRA法相比，DGGE法得到的聚类分析有更高的相似性，而ARDRA的相似性较低；ARDRA方法在一定的程度上对种群多样性有高估的可能性，而DGGE则会低估微生物种群的多样性。
微生物多样性;深海沉积物;西北太平洋;海洋生物学;分子生物学;种群多样性;海洋沉积
中国海洋大学
博士
海洋生物学
包振民
2005
中文
P736.21;Q93;Q938.8
114
2006-07-27（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）