南极冰藻Chlamydomonas sp.L4的逆境适应性及其抗逆蛋白质组学的研究
南极是地球上最冷的地区，低温是极地最基本的特征，严寒的气候在南极已存在至少1400万年。海冰中间存在大量网状的盐囊和盐通道，其中海水的盐度可以达到普通海水的3倍，甚至5倍。南极冰藻就是指生活在这些高浓度盐水孔洞中的一大类微藻。并且冰藻生活的冰层是一个低光照、寡营养和少气体交换的场所。同时，由于南极上空的臭氧空洞，南极地区UV-B辐射大大增加，对冰藻的生存和繁殖带来很大的影响。每年南极的春夏季，海冰的融化时冰藻周围的环境发生巨大的变化：温度升高，盐度降低，光照和UV-B辐射增强，气体交换频繁。日积月累海冰的冻溶变化中，冰藻逐渐形成了适应这种变化的生理生化机制。
正是由于冰藻这种特殊的生理特征，必然使其成为研究低温生物学的良好试验材料；此外，冰藻也是新型活性物质的潜在来源。为了更加合理的开发南极的低温藻类资源，从应用上丰富我国现有的微生物资源，从中开发出有价值的生理活性物质和产品，本文主要以南极绿藻L4(Chlamydomonassp.L4)为材料，对该藻的逆境适应性和抗逆蛋白质组学进行，以期为南极冰藻抗逆机理的研究和应用开发提供科学依据。对所取得的主要结果概括于下。
(1)以两种常温藻作对照，对南极绿藻L1和绿藻L4，硅藻的盒形藻、菱形藻、圆筛藻和蓝藻等6种南极冰藻的耐盐性进行测定。研究发现，5种南极冰藻对盐度的耐性一般要高于常温藻的，并且冰藻之间的耐盐性也存在种类之间的差异，抗盐性的顺序依次为硅藻＞绿藻＞蓝藻。
(2)以常温藻衣藻(Chlamydomonasmonadina)为对照，研究南极绿藻L4高盐胁迫下膜脂过氧化水平的变化。正常情况下，绿藻L4中MDA、SOD、脯氨酸含量较常温藻的高，高含量的脯氨酸可以维持细胞内外渗透压的平衡；高含量的SOD为主的活性氧清除剂，负责清除细胞内产生的活性氧；高含量的MDA对细胞的危害性很小。这些物质相互作用，维持细胞的正常代谢，使细胞膜透性处于一个平衡状态。在高盐胁迫下，细胞内MDA含量升高，活性氧增加，使细胞膜发生脂质过氧化，透性增加。同时细胞内SOD等抗氧化酶系统含量增加，清除产生的活性氧。以脯氨酸为主的渗透调节剂的含量也升高，调节胞内外的渗透平衡。细胞内物质的调节使生物体达到一个新的平衡，维持冰藻的正常代谢和生长。
(3)研究低温(-4～-6℃)、UV-B辐射(70μE·m-2·s-1)和高盐(99％)3种逆境胁迫下绿藻L4的膜脂过氧化水平和抗氧化酶系统的变化。结果表明，低温胁迫下，绿藻L4内高含量的SOD、POD和CAT等活性氧清除剂能够消除膜脂过氧化产生的O2·-，使MDA和脂氧合酶含量下降，膜脂过氧化水平降低。其中CAT的含量极低，在清除活性氧方面几乎没有作用。经过较强的UV-B辐射，绿藻L4体内产生了较多的活性氧，但CAT和SOD等清除剂活性减少或只有少量增加，此时膜脂过氧化水平提高。高盐胁迫下，冰藻细胞内的膜脂过氧化水平较低。而抗氧化酶系中POD和CAT的含量明显升高，SOD的含量减少，表明高盐胁迫下主要的活性氧为H2O2和·OH，而O2·-含量较少。由此可见，这3种胁迫条件下，几种抗氧化酶系统表现了较高的活性，不仅表现了清除自由基的能力，而且也是体现生物抗性的一种标志。
(4)利用分离效率高的水双相系统对南极绿藻L4的质膜进行提取，气相色谱方法分析低温和高盐胁迫下脂肪酸成分的变化。研究结果表明，南极绿藻L4细胞中含有较高的不饱和脂肪酸，这是对南极极端环境的一种适应。低温胁迫下，绿藻L4中饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸的含量明显下降，而多不饱和脂肪酸的含量明显升高，并且20碳以上的长链脂肪酸所占的比例明显降低。另外，一个最明显的变化就是C18：3脂肪酸含量的明显增加，新出现了两个不饱和脂肪酸C20：1和C20：3。由此可见，细胞膜中饱和脂肪酸含量的降低、不饱和脂肪酸含量的升高、支链的增加以及链长度的降低在绿藻L4的抗冻性方面起着重要的作用。高盐胁迫下绿藻L4质膜中饱和和单不饱和脂肪酸所占的比例增加，多不饱和脂肪酸减少，膜的流动性和渗透性降低，减少了高盐对质膜的损伤。
(5)利用光学显微镜、扫描和透射电镜对南极绿藻L4在低温(-4～-6℃)、UV-B辐射(70μE·m-2·s-1)和高盐(99％)胁迫下的形态和超微结构进行研究。结果表明，在正常条件下，同常温绿藻相比，绿藻L4的主要特点为：细胞壁较厚，无鞭毛端存在着明显的质壁分离现象，细胞内贮存有大量的淀粉颗粒，细胞壁和细胞膜之间充满大量的黑色颗粒物质。另外，绿藻L4中不仅有脂肪颗粒，更多的是淀粉颗粒，构成胞内的主要贮存成份。淀粉和脂肪作为贮存物质，在冰藻极地环境生存策略中发挥着及其重要的作用。重要的是绿藻L4的叶绿体呈不规则形状，遍布于整个细胞内。通过低温、UV-B辐射和高盐三种逆境胁迫后发现：南极绿藻L4的形态结构在低温下几乎没有发生变化，只有极少量淀粉颗粒的消耗。通过UV-B辐射，绿藻L4通过分泌胞外物质，增加细胞壁的厚度和未知黑色颗粒的密度把UV-B屏蔽在胞外，很好的保护了胞内的细胞器。高盐胁迫下，绿藻L4的形态发生了较大的变化，质膜产生了大量的皱褶，大量的淀粉颗粒被消耗，出现许多空泡。研究也发现，细胞中的类囊体片层、线粒体和细胞核都是十分稳定的器官，3种逆境胁迫条件都不能改变它们的结构，一直维持藻体细胞最基本的代谢和能量供应。
(6)经过反复试验，找到了一套适合于南极绿藻L4蛋白双向电泳分析的有效方法。液氮研磨加上石英砂研磨缓冲液的方法，可以完全破碎冰藻细胞；改进的三氯乙酸-丙酮沉淀法是有效的冰藻可溶性蛋白的提取方法，能有效去除冰藻中的色素、脂肪和盐分。在13cm的IPG胶条中150μg的上样量是比较适合的，蛋白质点基本没有重合，又能比较好的显示出蛋白质点。泡胀前样品与泡胀液混匀共同进行泡胀的方式，不仅方便而且还有利于蛋白质进入IPG胶。在胶条的两步平衡中，15min的平衡时间具有很好的效果，既不会影响一部分蛋白从IPG胶条转移到SDS胶的效率，也不会使部分蛋白溶于平衡液中，造成蛋白的损失。在蛋白质点的检测中，首先用灵敏度高的银染方法找出差异蛋白质点，然后加大上样量用考马斯亮蓝染色的方法切取差异蛋白质点进行指纹图谱分析。
(7)利用双向电泳的手段对低温(-4～-6℃)、UV-B辐射(70μE·m-2·s-1)和高盐(99％)胁迫条件下绿藻L4的蛋白质进行分析。辐射前后分别得到了356个和325个蛋白质点，辐射后12个蛋白质点含量明显提高，7个蛋白质点消失，16个蛋白质点的合成量明显下降，合成了2个新的蛋白质点(20kDa和21kDa)。通过数据库检索，确定其中的一个蛋白质点可能为Mn-SOD，在消除自由基和活性氧方面起重要作用；另一种可能为NADH-辅酶Q氧化还原酶的亚基，在生化过程中起电子传递作用，给生物体供给能量。这些变化的蛋白质在绿藻L4的抗辐射方面起重要作用。高盐胁迫前后分别得到了626和652个蛋白质点，高盐胁迫后18个蛋白质点含量明显提高，8个蛋白质点消失，28个蛋白质点明显下降，同时新合成了1个新的蛋白质点(MW51kDa,pI6.90)。通过数据库检索，确定这种蛋白质可能为光系统Ⅱ中光反应中心蛋白CP43的前体，增加了高盐环境中绿藻L4的光合能力。低温胁迫前后分别得到了467个和429个蛋白质点，¨个蛋白质点含量明显增加，4个蛋白质点消失，6个蛋白质点的合成量明显下降，同时新合成了2个新的蛋白质点。
(8)利用肽质量指纹图谱方法和数据库检索对低温诱导下2个新合成的绿藻L4蛋白质进行鉴定。结果证明，这2个新出现的蛋白质分别为异丙基苹果酸/高柠檬酸/二甲基苹果酸合成酶和谷胱甘肽硫转移酶。异丙基苹果酸/高柠檬酸/二甲基苹果酸合成酶，在氨基酸和蛋白质的合成中起重要作用，可以弥补由于温度下降带来的酶活性降低的不足。谷胱甘肽硫转移酶，可以清除绿藻L4细胞中由于低温而产生的活性氧和脂质过氧化的有毒产物，使绿藻L4更好的适应南极极端的低温条件。
(9)对5种南极冰藻，即绿藻L4和绿藻B7以及硅藻的盒形藻、菱形藻、圆筛藻的测定结果表明，冰活性物质的活性存在种间特异性，冰活性物质浓度的大小依次为绿藻L4＞盒形藻＞菱形藻＞圆筛藻＞绿藻B7。对绿藻L4抑制冰晶活性测定表明，含有冰活性物质的溶液所形成的冰晶颗粒较小，并且颗粒之间缝隙较大，能够减轻生物体结冰带来的伤害。
总之，从生理生化变化、形态结构、膜脂肪酸变化和蛋白质变化的角度，以及冰活性物质方面分析南极绿藻L4对低温、强UV-B辐射和高盐环境的适应性，发现南极绿藻L4对南极环境有很好的适应性。其实，南极冰藻生长在高盐、低光照、强辐射和低温的盐囊微环境中，同时盐囊中含有大量的活性氧，冰藻必需同时来抵御一系列的环境胁迫，所以，我们在分析冰藻的生存环境时，必需把这几个方面综合考虑，才能更准确地理解冰藻对南极极端环境的适应性。
南极冰藻;绿藻形态学;超微结构;逆境适应性;蛋白质组学;海洋生物学
中国海洋大学
博士
海洋生物学
李光友;缪锦来
2005
中文
Q949.2;P735
148
2006-07-27（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）