钝顶节旋藻cpcB基因上游序列结构功能的研究
以绿色荧光蛋白基因(gfp)为报告基因，构建了由钝顶节旋藻藻蓝蛋白cpcB基因上游序列驱动的绿色荧光蛋白表达载体，通过荧光显微镜检测和流式细胞仪证明，GFP能够在大肠杆菌中表达。SDS-PAGE分析表明，GFP在37℃条件下的表达水平约占菌体总蛋白的16％左右，推测在藻蓝蛋白基因上游序列中可能存在较强的启动子元件。并且GFP在大肠杆菌中的表达受到培养温度的影响，温度越高，表达水平越高。对翻译起始区(TIR)的软件分析和突变分析显示，一种RNA的特殊二级结构(RNA温度计)与温度的影响有关，在钝顶节旋藻藻蓝蛋白cpcB基因的TIR中，可能也存在这种结构。
启动子分析软件预测显示，在cpcB基因上游序列中存在6条启动子，并采用定点突变方法分离，实验证明每条启动子均能单独控制GFP表达。通过流式细胞仪对GFP表达水平分析显示，第三条启动子的强度最高，第四条次之。通过对第三条启动子-35元件(TTCTCA)的点突变分析发现，C和T两个碱基对保持启动子的强度是非常重要的，任何突变均可引起GFP表达量严重下降。
在cpcB基因上游序列中有6个短的开放阅读框，其中三个可能具有编码功能，推测这些开放阅读框或其基因产物可能参与藻蓝蛋白基因的表达调控。在-321-371的区域富含AT(90％)，它的缺失引起GFP表达水平下降，说明该AT区域对启动子的活性有促进作用。
采用SmartRace技术对藻蓝蛋白基因的转录特征进行了分析。在藻体内藻蓝蛋白基因只有一条转录产物，从PCR产物的大小和对转录起始位点的分析可知，基因的转录是由第一条启动子决定的。还克隆了节旋藻其他品系的cpcB基因的部分上游序列和编码区的部分序列。所扩增的片段长度分别为474bp，包括257bp的上游序列和217bp的编码区序列。所克隆的上游序列，以及FACHB438，FACHB793和FACHB790的cpcB基因编码区序列未见报道。从比对结果看，供试的7个序列的碱基变异不大。在474bp中，共有31处变异，其中上游序列21处，编码区10处，且变异主要集中在FACHB439，其他序列仅个别碱基的改变。cpcB基因的上游序列的相似性表明，不同品系的节旋藻的藻蓝蛋白基因可能存在共同的表达调控机制。
通过同源重组的方法，将藻蓝蛋白基因上游序列及其驱动的gfp基因整合到聚球藻Synechococcussp.PCC7942的基因组中，通过荧光显微镜检测和流式细胞仪证明，GFP能够在其中表达，从而构建了以异源蓝藻为宿主的报告基因表达系统。并考察了光强对GFP表达的影响。实验证明，光强对GFP表达的有一定的影响。光强在10μmolm-2s-1时，GFP表达水平最高。当低于10μmolm-2s-1时，光强度越小，GFP表达水平越低。当光强大于10μmolm-2s-1时，光强度越高，GFP表达水平反而越低。通过cpcB基因上游序列5'端缺失分析，在-218至-276的区域可能存在光反应元件。
在该报告系统还考察了硫、磷、氮、铁等元素缺乏对GFP表达的影响。在营养元素缺乏的情况下，GFP的表达水平均有不同程度的下降。其中，硫元素缺乏对GFP的表达影响相对较小，而氮元素缺乏对GFP的表达影响相对较大。
节旋藻;绿色荧光蛋白;基因突变;启动子;c-藻蓝蛋白;大肠杆菌
中国海洋大学
博士
海洋生物学
张学成
2005
中文
Q949.2;Q344.12
141
2006-07-27（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）