用对虾血细胞单克隆抗体研究分析白斑症病毒的受体
通过白斑症病毒(WSSV)与对虾血细胞膜的体外结合方法和对虾血细胞原代培养的方法，从研制出的抗对虾血细胞的单克隆抗体中，筛选出抗WSSV受体的单克隆抗体，并用Westernblot和亲和层析方法鉴定了WSSV受体的分子量。实验结果如下：利用WSSV和对虾血细胞膜体外结合的DOTBLOT方法，从抗中国对虾血细胞的单克隆抗体中筛选出单克隆抗体4D8具有部分封闭WSSV和对虾血细胞膜结合的作用。对虾血细胞膜和有部分封闭作用的单克隆抗体4D8反应，再和地高辛标记的WSSV(WSSV-DIG)孵育，由于部分受体被封闭使WSSV-DIG无法与其结合，由DOTBLOT得到的结果颜色较浅；对虾血细胞膜和无封闭作用的单克隆抗体反应，再和WSSV-DIG孵育，由于WSSV-DIG与对虾血细胞膜上的所有受体结合，由DOTBLOT得到的结果颜色较深。
利用WSSV和对虾血细胞膜体外结合的ELISA方法，对单克隆抗体4D8的封闭效果进行了定量分析。对虾血细胞膜和无封闭作用的单克隆抗体反应，再和WSSV-DIG孵育，由于WSSV-DIG与对虾血细胞膜上的所有受体结合，由ELISA得到的OD值较大，为0.423；对虾血细胞膜和有封闭作用的单克隆抗体4D8反应，再和WSSV-DIG孵育，由于部分受体被封闭使WSSV-DIG无法与其结合，由ELISA得到的OD值较小，为0.256，占受体不被封闭所得OD值的41％。
用对虾血细胞原代培养的方法对单克隆抗体4D8的封闭效果进一步验证：与无封闭作用的单克隆抗体孵育的原代培养的血细胞，经WSSV感染后，第3天就表现出了病理变化；与有封闭作用的单克隆抗体4D8孵育的原代培养的血细胞，经WSSV感染后，出现病理变化较晚，第5天才表现出了病理变化。实验结果表明：单克隆抗体4D8能封闭部分WSSV受体，从而延缓了WSSV对原代培养血细胞的感染进程。
经Westernblot和亲和层析技术鉴定，抗WSSV受体的单克隆抗体4D8在中国对虾血细胞膜上识别的WSSV受体的分子量为175kDa。单克隆抗体4D8在日本对虾血细胞上识别的抗原决定簇分子量为175kDa，在凡纳滨对虾血细胞上识别的抗原决定簇分子量为200kDa，在克氏原螯虾血细胞上识别的抗原决定簇分子量为200kDa。
抗大颗粒细胞的单克隆抗体1B4与WSSV感染的对虾血细胞反应并经过苏木精溶液衬染后，通过显微镜观察统计每个视野的细胞数量：在感染的第1、2、3天，WSSV感染组凡纳滨对虾的血细胞总数呈逐渐上升的趋势，大颗粒细胞占血细胞总数的比例增加较大。在随后的几天，血细胞总数显著下降；大颗粒细胞的数量也呈下降的趋势；大颗粒细胞占血细胞总数的比例，从第3天的45.9％下降到第8天的43.3％，但仍明显高于第1天的15.2％。
通过免疫荧光检测技术，抗凡纳滨对虾三类血细胞的单克隆抗体1B4与凡纳滨对虾胚胎的冰冻切片反应：早期的胚胎呈现出点点的明亮荧光，说明凡纳滨对虾在胚胎发育期就已有了成虾血细胞的组分。用抗凡纳滨对虾大颗粒细胞的单克隆抗体1H11检测胚胎和无节幼体各期的冰冻切片，发现从蚤状幼体Ⅲ期才开始出现少量的阳性血细胞。
综上所述，本文筛选出了抗WSSV受体的单克隆抗体4D8，鉴定出WSSV受体的分子量为175kDa，为探明WSSV感染的分子机制提供了研究基础。同时，研究了对虾被WSSV感染后血细胞的变化和对虾幼体血细胞的发生。
单克隆抗体;对虾血细胞;白斑症病毒;受体;水生生物学
中国海洋大学
博士
水生生物学
战文斌
2005
中文
S945.46;R758.41
110
2006-07-27（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）