文昌鱼cathepsin、β-MSP和allantoicase基因的特征、表达和进化研究
文昌鱼是介于无脊椎动物和脊椎动物之间的过渡型动物，正在成为研究脊椎动物起源和进化的模式动物。过去10多年，对文昌鱼基因克隆和表达的研究主要集中在中胚层和外胚层(特别是神经外胚层)方向，而对内胚层相关基因关注较少。本文研究了四个与内胚层(消化道)功能相关的基因，包括克隆、结构、表达和进化分析。
首先，从青岛文昌鱼消化道cDNA文库中克隆到两个长1480bp和1700bp的cDNA，最大阅读框分别编码327个氨基酸和333个氨基酸的蛋白质，理论分子量分别为36.3和36.5KDa。氨基酸序列中分别具有cathepsinL特征序列ERFNIN和cathepsinB的特征性的闭塞环。因此，这两个cDNA分别编码文昌鱼的cathepsinL和cathepsinB，并分别被命名为AmphiCL和AmphiCB。系统进化树分析，AmphiCL及AmphiCB都分别和无脊椎动物组织蛋白酶L和组织蛋白酶B聚类，支持了在系统进化上文昌鱼是脊椎动物和无脊椎动物之间的过渡类型的观点。此外，本文克隆到的全长为2980bp的文昌鱼cathepsinL基因组DNA表明，其中共有六个内含子，而目前已知的无脊椎动物虾Penaeus的cathepsinL的基因组DNA有5个内含子，哺乳动物则有7个内含子，cathepsinL的基因组DNA的内含子的数量和进化的关系尚需进一步研究。RT-PCR、Northernblot和文昌鱼成体组织的切片原位分析表明，AmphiCL和AmphiCB在文昌鱼的各个组织都表达，但在文昌鱼的肝盲囊和后肠表达丰度最大，提示文昌鱼的组织蛋白酶L和B都和文昌鱼的消化功能有关。胚胎整体原位杂交表明，AmphiCL在2天幼虫的原始消化管中开始表达，AmphiCB在1天幼虫的原始消化管中开始表达，提示对于文昌鱼幼虫，组织蛋白酶B比组织蛋白酶L更先发挥其生理功能作用。对AmphiCL功能的进一步分析，通过对文昌鱼进行螺旋藻投喂和细菌外毒素LPS的处理发现，文昌鱼cathepsinL和食物的消化呈负相关关系；文昌鱼cathepsinL对细菌外毒素起急性炎症应急反应。
第三个从青岛文昌鱼消化道cDNA文库中克隆到的基因是β-microseminoprotein-like(β-MSPL)基因。文昌鱼β-MSPL有111个氨基酸，理论分子量12.3KDa。和其它物种的β-MSP的Alignment分析表明，文昌鱼β-MSP-like在氨基酸水平上和脊椎动物β-MSP只有12-20％的同源性。文昌鱼β-MSP-like和其它物种的β-MSP不同的是，文昌鱼β-MSP-like的N-端不具有信号肽，而且只有8个半胱氨酸保守，而其它物种β-MSP中的10个半胱氨酸全部保守。这些不仅证实了以前的β-MSP在系统进化中是快速进化的蛋白质的观点，而且提供了β-MSP因物种多样性而不同的证据。系统进化树显示，文昌鱼β-MSP-like和鱼的β-MSP聚类。RT-PCR和Northernblot结果显示，文昌鱼β-MSP-like在成体的各个被检测的组织中表达，但在脊索中表达丰度最大，可能和文昌鱼脊索的功能有关。在文昌鱼胚胎发育的过程中，整体原位杂交结果表明，从文昌鱼胚胎的四细胞到原肠胚，β-MSP-like阳性信号在胚胎中到处表达；文昌鱼神经胚的早期，β-MSP-like仅在中内胚层表达；晚期神经胚(约10个体节期)，β-MSP-like在脊索、体节和原始的消化管中表达；文昌鱼的一天幼虫，仍然是脊索、体节和原始消化管检测到β-MSP-like阳性信号。提示β-MSP-like在文昌鱼胚胎发育过程中和外胚层的分化有关。这是首次关于β-MSP在动物胚胎发育中表达的报道。
本文报道的最后一个从青岛文昌鱼肠cDNA文库中克隆到的基因是allantoicase基因。文昌鱼allantoicase有392个氨基酸，分子量约43.2KDa。氨基酸序列中含有尿囊酸酶的特征motif：DGWET(S)RR、PDGG和DGWETAR。PSORTⅡ程序分析表明，文昌鱼尿囊酸酶具有43.5％的概率是细胞质定位(21.7％概率线粒体或过氧化物酶体定位)。ProtparamToolprogram分析结果显示，和高等动物蛙、斑马鱼allantoicase一样，文昌鱼allantoicase是不稳定的酶，结果提示，头索动物发生了尿囊酸酶稳定性的丢失。根据文昌鱼尿囊酸酶和其它12种物种尿囊酸酶构建的进化树，文昌鱼尿囊酸酶和斑马鱼的尿囊酸酶聚类，提示文昌鱼尿囊酸酶和脊椎动物尿囊酸酶具有很近的亲缘关系。RT-PCR分析了allantoicase在文昌鱼中的组织分布。文昌鱼allantoicase在肝盲囊中表达丰度最大，在其它被检组织表达很弱。通过对文昌鱼各组织的allantoicase酶活测定，在文昌鱼肝盲囊，尿囊酸酶活最高，而精巢、卵巢和后肠酶活较低。在其它组织没有检测到尿囊酸酶的活性。文昌鱼allantoicase酶活的组织特异性，在爪蟾中也有类似的报道。
文昌鱼;基因特征;进化分析;过渡型动物;基因克隆;基因表达;海洋生物学
中国海洋大学
博士
海洋生物学
张士璀
2005
中文
Q959.287;Q344.13
146
2006-07-27（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）