三种重要海水养殖鱼类的分子遗传学研究
近年来，虽然海水鱼类养殖业发展迅速，但育种工作的滞后却成为制约养殖业进一步发展的瓶颈。牙鲆、大菱鲆、真鲷是当前我国重要的海水养殖鱼类。然而，对这些鱼类育种工作中遇到的一些基础问题如群体遗传结构分析、选择性养殖群体同普通群体的遗传差异比较、超低温保存后鱼苗的遗传多样性评估、微卫星标记筛选等研究较少，本文针对这些重要海水养殖鱼类在育种工作中遇到的上述问题利用AFLP、SSR、ISSR、RAPD分子标记技术进行了探讨。利用AFLP、SSR、ISSR、RAPD标记比较了牙鲆普通群体和选择性养殖群体的遗传结构差异；利用AFLP标记筛选到了部分牙鲆抗病候选标记；利用SSR标记分析了超低温保存精子孵化的大菱鲆的遗传多样性；从真鲷cDNA文库中开发了一批微卫星标记；以期加快这些重要海水养殖鱼类在遗传变异分析、分子标记辅助育种、重要经济价值基因定位及遗传图谱构建等方面的研究工作。本文的主要工作及结论如下：
1.利用10对AFLP引物组合对三个牙鲆群体60个个体进行了遗传结构分析。普通群体、感病群体和抗病群体扩增的条带总数分别为491、462、485，两个选择性养殖群体的总带数都低于普通群体。普通群体的多态性位点总数为323，而感病群体和抗病群体分别为284和279，普通群体的多态性位点总数显著(P＜0.05)高于选择性养殖群体。三个群体的多态位点百分比(PPB)分别为65.78％(普通群体)，61.47％(感病群体)，60.927％(抗病群体)。另外，发现三个群体的一些AFLP位点存在频率差异。在低频区间(0～0.2)，普通群体的位点数显著(P＜0.05)多于两个选择性养殖群体；而在高频区间(0.6～1.0)，选择性养殖群体的位点数又多于普通群体。这说明选择性养殖群体同普通群体之间已经产生了一定的遗传距离。
2.利用61对AFLP引物组合扫描了牙鲆感病群体和抗病群体各20个个体，虽然没有发现在一个群体中全显性而在另一个群体中全隐性的标记。但有一些AFLP条带在两个群体中显示了极大的差异，这些标记很可能就是与抗病相关的候选标记。其中有2条带是在抗病群体中出现的高显性基因频率的标记，另外6个是在感病群体中出现的高显性基因频率的标记。将这些片段回收、克隆、测序后即获得这些与抗病相关候选标记的序列。
3.应用10对微卫星引物对三个牙鲆群体共90个个体进行了群体遗传多样性分析。共得到76个等位基因，等位基因的大小在120～350bp之间。普通群体的平均等位基因数为7.6，显著(P＜0.05)高于感病群体的5.80，略高于抗病群体的7.2。普通群体10个位点的平均基因型数为11.4，而感病群体和抗病群体分别只有8.3和9.0。普通群体的平均有效等位基因数为3.97，略高于感病群体和抗病群体的3.78和3.72。普通群体10个位点中最高频率等位基因的平均值为0.388，而感病群体和抗病群体分别为0.407和0.425。普通群体低频等位基因(0～0.05)总数为27个，而感病群体和抗病群体分别只有15个和19个。普通群体共得到14个私有等位基因，感病群体和抗病群体仅各得到3个等位基因。研究结果表明了感病群体和抗病群体两个选择性养殖群体遗传多样性的降低。
4.利用12条ISSR引物对三个牙鲆群体进行了遗传结构分析。12条ISSR引物在45个牙鲆个体中共产生了106条ISSR带，分子量在250～1500bp之间，其中38条是多态性的，平均每条引物产生8.83条带。普通群体共产生了106条ISSR带，而感病群体和抗病群体分别产生了98和97条带。普通群体的多态性位点总数为36个，其PPB值为33.96％；而感病群体和抗病群体的多态性位点总数分别为27和26个，它们的PPB值分别为27.55％和26.80％。普通群体的多态位点显著(P＜0.05)高于感病群体和抗病群体。香农指数在普通群体和选择性养殖群体之间也显示出了较大的差异，普通群体的值为0.1432，而感病群体和抗病群体分别为0.1185和0.1160。由普通群体得到的总基因型数为40，感病群体和抗病群体各获得31和33个基因型，显示出了显著的差异(P＜0.05)。普通群体的平均杂合度为0.1072，感病群体和抗病群体分别为0.0925和0.0913，选择性养殖群体的平均杂合度略有降低，但差别不显著。这些都表明了感病和抗病群体遗传多样性的降低。
5.利用12条RAPD引物对三个牙鲆群体进行了遗传结构分析。12条RAPD引物在60个牙鲆个体中共产生了71条带，分子量在100～2000bp之间，其中35条带在三个群体中呈现出多态性，平均每条引物产生5.9条带。普通群体共产生了69条RAPD带，而感病群体和抗病群体分别产生了66和64条带，显示出了降低的趋势。普通群体的多态性位点总数为30个，其PPB值为43.48％；而感病群体和抗病群体的多态性位点总数分别为28和27个，它们的多态位点百分比(PPB)值分别为42.42％和42.19％。普通群体的PPB值略高于感病群体和抗病群体的PPB值，但差异不显著。普通群体的香农指数也高于其它两个选择性养殖群体，普通群体的值为0.1472，而感病群体和抗病群体分别为0.1281和0.1255。由普通群体得到的总基因型数为39，高于感病群体和抗病群体的35和37个。普通群体的平均杂合度为0.1122，感病群体和抗病群体分别为0.1025和0.1113，三者的平均杂合度无太大区别。
6.同牙鲆普通群体相比，AFLP、SSR、ISSR和RAPD的研究结果都表明了感病和抗病群体遗传多样性的降低。AFLP标记平均每对引物产生的带最多，即能够检测到的牙鲆基因组位点最多，ISSR标记次之，RAPD检测到的位点最少，充分显示出了AFLP标记的高效性。但微卫星标记比RAPD、ISSR和AFLP标记显示出了更强的遗传检测能力。
7.利用微卫星技术对大菱鲆冻精和鲜精受精鱼苗的遗传结构进行了比较分析，以检验冷冻保存对精子遗传结构的影响。精子超低温保存按三步法进行，冻后成活率为65％(对照为85％)。精子在液氮中保存半小时后解冻授精，冻精受精率和孵化率与鲜精没有显著差异。实验用冻精和鲜精受精鱼苗各15条，且来自相同的父母本，减少了亲本遗传结构不同对实验结果的干扰。10对微卫星引物的分析结果显示，15条鲜精受精大菱鲆苗共得到等位基因30个，基因型25个，杂合度为0.5747；15条冻精受精大菱鲆苗共得到等位基因30个，基因型25个，杂合度为0.5714。在鲜精受精大菱鲆和冻精受精大菱鲆的30个等位基因中，只检测到7个等位基因的频率有较大差异。
8.构建了真鲷cDNA文库。利用SSRHunter软件从2010个测序的真鲷cDNA克隆中共获得103条微卫星序列。统计分析表明，含微卫星序列的克隆占总克隆数的5.12％。在所有重复类型中，以两碱基重复数目最多，为73个，占重复序列总数目的70.87％；其次是三碱基重复，22个，占21.36％；再次分别是四碱基7个，占6.80％，五碱基1个，占0.97％，没有发现六碱基以上的重复类型。在两碱基重复序列中，AG重复类别最多，为33个，占总重复序列数目的32.04％，其次是AC和AT,分别为30(29.13％)和10(9.71％)个，没有发现核心序列为GC的重复类别。三碱基重复中，共发现8种重复类别，它们分别是AAT、AAG、ACG、AGG、AGC、ACT、GCC、ATC。其中，以AAT最多，6个(5.83％)，其次是AGC，4个(3.88％)，再次是AAG、ACG、AGG，各为3个(2.91％)，最少的是ACT、GCC、ATC，都仅有1个，占0.97％。四碱基重复中，共发现7种重复类别，它们分别是ACCA、CACT、CTTT、GTAT、CTGT、GCCA、AAAT，分别各有1个(0.97％)。五碱基重复中，只发现1种重复类别AATCT。
9.从获得的103条含微卫星序列的ESTs中，选取了28条进行引物设计。在25对有扩增产物的引物中，经过PCR扩增和聚丙烯酰胺凝胶电泳进一步筛选后，共获得有多态性产物的微卫星引物11对。在这11个微卫星位点中，等位基因的数目从2(CM000278和CM001034)到8(CM001742)不等，等位基因的大小在100～595bp之间，观测杂合度和预期杂合度的范围分别为0.33～1.00和0.38～0.83。11个微卫星位点中，只有5个处于Hardy-Weinberg平衡(HWE)状态，6个位点处于不平衡状态，其中一个位点(CM002640)显示杂合缺失，其它5个位点显示杂合过剩。连锁不平衡分析表明11个位点之间没有显示出显著的连锁。为了检验筛选的这些真鲷微卫星标记能否应用到其它一些海水鱼类上，利用此11对真鲷微卫星引物对黑鲷、牙鲆、大菱鲆、花鲈、半滑舌鳎5种鱼类DNA进行了扩增试验。结果表明，黑鲷中有6个位点有扩增产物且都显示了多态性；牙鲆中仅有2个位点有扩增产物，只有CM001034位点显示了多态性；花鲈中有3个位点有扩增产物，2个位点呈现单态性，另一个位点(CM001143)显示了较高的多态性，6个花鲈个体中出现了5个等位基因；大菱鲆和半滑舌鳎没有一个位点显示多态性。
牙鲆;大菱鲆;真鲷;分子标记;遗传变异;海水鱼类养殖;海水鱼类;分子遗传学
中国海洋大学
博士
水产品加工与贮藏工程
李八方;陈松林
2005
中文
S965.3;Q75
136
2006-07-27（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）