菲律宾蛤仔附着变态过程中的差异基因表达与基因克隆
菲律宾蛤仔(RuditapesphilippinarumAdamsetReeve)又称蛤仔，广泛分布在我国黄、渤海海区，其肉味鲜美，营养丰富，为我国四大养殖贝类之一，是捕捞和人工养殖的对象。随着人们生活水平的日益提高，市场对该贝苗种的需求亦日益增加。附着变态过程是贝类生活史中的关健时期，是幼虫向成体转变的重要环节。蛤仔苗种的产量和质量在很大程度上取决于幼苗的附着变态过程，幼苗附着变态的成功与否往往决定着出苗量和育苗的成败。因此研究其受精生物学、胚胎发生、附着、变态等基础生物学的工作已引起科研工作者的重视，然而从分子水平方面阐明附着变态机理的研究还不太深入。本论文以菲律宾蛤仔附着变态时期的幼苗为实验材料，采用分子生物学技术，试图从分子水平上找出与菲律宾蛤仔附着变态及发育相关的基因，为贝类幼苗发育生物学，生理学及分子生物学的发展提供参考，同时为苗种业的开发提供一定的基础理论依据。主要结果如下：1.采用DDRT-PCR技术，以受精后壳顶前期、壳顶期、眼点期、稚贝期的菲律宾蛤仔幼虫为实验对象，研究菲律宾蛤仔幼虫不同发育时期的基因表达，进而找出与菲律宾蛤仔附着变态相关的基因。
2.研究了肾上腺素、去甲肾上腺素、多巴胺、γ-氨基丁酸、KCl和CaCl2，在不同剂量和不同的诱导持续时间下，对菲律宾蛤仔眼点幼虫附着变态的诱导作用。在此基础之上，选取出最佳而又经济的神经递质类物质肾上腺素(使用浓度为10-6M，诱导时间为4h)，同样也采用DDRT-PCR技术，6组引物组合，扩增出343条带，67条具有明显表达差异，其中的18条在对照组中有高表达，而另外的49条差异带在实验组中有高表达，表明这些差异带所代表的基因都和肾上腺素诱导有关，同时也从分子生物学水平上证明了肾上腺素参与了贝类附着变态机理的调控过程。
3.以菲律宾蛤仔眼点幼虫为实验材料，应用RACE技术，克隆了菲律宾蛤仔的replacementhistoneH3.3的全长cDNA序列(AY916800);菲律宾蛤仔H3.3的基因组序列扩增结果表明：序列L[AY916802]大小为1214bp，含有一个长803bp的内含子;另一序列S[AY916803]长约411bp，不具有内含子。序列L和S编码和H3.3完全相同蛋白质序列，这表明菲律宾蛤仔的H3.3cDNA可能有多个序列编码，也可能序列L为菲律宾蛤仔的H3L-like序列。在这个研究中，我们还克隆了菲律宾蛤仔的组蛋白H3基因序列，分析表明H3和H3.3编码的蛋白质序列只有四个氨基酸的差异，表明H3和H3.3及H3L-like存在着密切的关系，因此我们对它们特殊进化地位及复制依赖性的组蛋白和复制不依赖的组蛋白进化起源进行了讨论。本研究支持histoneH3.3为H3的祖先基因的观点，但我们认为H3L-1ike可能是组蛋白基因进化过程中的过渡基因，而非祖先基因。原位杂交实验表明H3.3在外套膜及鳃的特异性部位都有较大量的表达，后期正在进行菲律宾蛤仔不同发育时期的胚胎及其它组织和器官的原位杂交实验。构建pGEX-4T-H3.3表达载体，转化原核生物DH5α受体菌后，在蛋白上清液中得到很好的表达，Westernblotting进一步证明表达的确实是GST融合蛋白；目前抗体制备工作正在进行，为后期免疫检测实验作好了准备。原位杂交实验及抗体制备后要进行的免疫学实验都试图证明H3.3生物学功能及其与贝类附着变态的关系，为贝类分子生物学的发展提供基础理论依据。
菲律宾蛤仔;附着变态;组蛋白H3;组蛋白H3.3;差异基因;基因表达;基因克隆
中国海洋大学
博士
海洋生物学
包振民
2005
中文
S944.47;Q344.13
107
2006-07-27（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）