有益菌A18菌株铁载体的研究和铁吸收调节蛋白（Fur）基因的克隆和表达
利用甲基磺酸乙酯(EMS)、亚硝酸钠、溴化乙啶(EB)和紫外线(UV)对海洋有益细菌A18(Alteromonasaurantia)进行复合诱变，得到一株铁载体高产菌株J61321。对J61321抑菌活性[以鳗弧菌W-1(Vibrioanguillarum)作为指示菌]、所产铁载体的种类以及其性质进行了研究，结果显示出发菌株A18及突变株J61321所产铁载体均属于异羟肟酸类，而指示菌W-1所产铁载体为儿茶酚类；突变株J61321在铁载体产量、抑菌活性、对沸水浴的耐受性以及抗铁螯合剂方面都优于出发菌株A18。对铁载体高产菌株J61321的生长和产铁载体的液体培养条件进行了优化。采用单次单因子(one-variable-at-a-time)方法对培养基组分(碳源、氮源)和培养条件(起始pH、培养温度)进行了优化研究，最终得到突变株J61321的最佳培养基和培养条件为：酵母粉0.1％(W/V)，蛋白胨0.2％(W/V)，FePO40.001％(W/V)，培养温度28℃，摇床转速180rpm，pH7.5，在生长20小时后铁载体达到最大产量。研究了A18和J61321菌株的生长量(OD600nm)、铁载体产量和抑菌活性随培养时间的变化，结果显示二者的生长量差距不大(p＞0.05)，铁载体产量和抑菌活性之间存在显著性差异(p＜0.05)。
利用有机溶剂萃取法和大孔径树脂吸附法两种方法分别提取铁载体粗品，经HPLC初步分离，收集抑菌活性和CAS检测结果均为阳性的组分。利用高效液相色谱/二极管阵列检测/质谱法对活性组分进行再次分离，采用ESI-MS，采集正离子质谱数据，根据分离组分的分子离子峰推测组分Ⅰ为铁色素，组分Ⅱ为铁草铵(ferrioxamine)。
以橙色交替单胞菌A18中提取的染色体DNA为模板，根据革兰氏阴性菌fur同源性设计的上下游引物，通过PCR技术扩增到A18的fur基因。将PCR产物克隆到T载体上，转化大肠杆菌JM109，筛选阳性克隆进行DNA序列分析，结果表明PCR扩增的DNA片段编码148个氨基酸，与GenBank报道的革兰氏阴性菌的相应序列同源性很高(与大肠杆菌的Fur蛋白的相似性为70％，与Alteromonassp0-7的相似性为97％)，通过在线结构模拟，发现其结构与已经报道的Fur蛋白的结构相同。将橙色交替单胞菌fur基因克隆到非融合表达载体pQE上，构建表达质粒pQE-fur，转化大肠杆菌QCl732，筛选表达菌株QC1732(pQE-fur)。实验结果发现，在富铁条件下，通过IPTG诱导表达的Fur蛋白可以抑制铁载体的合成和分泌。
海洋有益菌;铁载体;复合诱变;基因克隆;基因表达;海洋生物;铁吸收调节蛋白;海洋有益细菌;细菌生物学
中国海洋大学
博士
海洋生物学
池振明
2005
中文
P735;Q344.13;Q813.5
115
2006-07-27（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）