有机锡化合物和烟碱类杀虫剂对牙鲆鱼鳃细胞株（系）的毒性效应与机理研究
人类使用的化合物据估计已近十万余种，并且还在以每年700多种的速度上升。其中对大部分化合物的潜在毒性缺乏研究。近年来细胞培养已被广泛地应用于对化合物的毒性检测。本文将来自牙鲆鱼鳃的永生细胞系FG应用于有机锡化合物和烟碱类杀虫剂的细胞毒性检测及毒性机理的探讨研究中，在国内首次建立了利用永生海水鱼细胞系检测有机锡化合物和烟碱类杀虫剂的体外毒性分析方法，并结合对FG细胞的抗氧化防御系统的两种酶(SOD、GSH-Px)和腺苷三磷酶(ATPase)的活性，以及DNA电泳分析探讨了有机锡化合物和烟碱类杀虫剂的毒性作用机理。
有机锡化合物三丁基氧化锡(TBTO)的急性细胞毒性研究结果发现：1)在1.7×10-10到1.3×10-7mol/L浓度下细胞生长速度受到明显抑制。2)在TBTO作用下，FG细胞系的超微结构改变表现为：线粒体损伤严重，随着浓度的增加线粒体的损害加重，内嵴肿胀、破裂甚至溶解；内质网的间隙增大，核糖体从粗面内质网上脱落下来，游离于胞质中。
对于TBTO致毒机理的研究，首先用分光光度法研究了谷光苷肽过氧化物酶(GHS-Px)和超氧化物歧化酶(SOD)在相同剂量(40ng/mL)不同时间的TBTO作用下的反应，发现在TBTO暴露组的FG细胞的SOD和GSH-Px的活性在短时间内升高，当FG细胞在TBTO环境下暴露2小时，SOD和GSH-Px的活性达到最高；但随着作用时间的延长，两种酶的活性出现抑制现象。这一现象提示：在TBTO短时间作用下，FG细胞的抗氧化系统酶被激活，产生应激性反应，SOD和GSH-Px活性升高。但随着暴露时间的延长，FG细胞自身抗氧化防御系统也遭到破坏，即表现为抑制现象。对40ng/mL的TBTO暴露组不同时间段的FG细胞进行DNA提取后，用琼脂糖凝胶电泳法对所提取的DNA进行检测，在8小时和12小时两个时间段发现降解DNA，形成典型的“DNAladder”现象。这说明TBTO对FG的毒性作用启动了FG细胞的程序性死亡(即细胞凋亡)。该现象提示：TBTO可以导致FG细胞发生凋亡。而线粒体的损伤是导致细胞产生凋亡的直接原因，这与毒性机理研究中线粒体的超微结构改变的结果相一致。
烟碱类杀虫剂吡虫啉对牙鲆鱼鳃永生性细胞系FG应用于体外急性毒性检测的结果表明：吡虫啉浓度在0.5μg/mL就对细胞表现出毒性效应，且毒性呈现出浓度依赖性。用中性红、MTT和细胞总蛋白检测三种方法检测到60μg/mL吡虫啉48小时的半数抑制浓度IC50值分别是41.86、38.46和39.08μg/mL。超微结构研究显示将细胞暴露在60μg/mL含有吡虫啉的培养基中48小时，线粒体受到严重破坏，如：内嵴肿胀或瓦解，但细胞核和粗面内质网仍然正常，这表明线粒体可能是吡虫啉最先影响的靶细胞器。
对啶虫眯的体外急性毒性检测中发现，最低有效浓度为1μg/mL，且毒性效应与啶虫眯的浓度呈线性关系。60μg/mL的啶虫眯48小时的半数抑制浓度IC50分别为38.38、36.27和32.03μg/mL。超微结构观察结果也表明线粒体受损最严重。线粒体是啶虫眯毒性作用的靶位点。
在探讨烟碱类杀虫剂的致毒机理时，首先用分光光度法检测了暴露于浓度为60μg/mL吡虫啉和啶虫眯环境下的FG细胞和非暴露组FG细胞的SOD，GSH-Px及ATPase，除啶虫眯暴露组的SOD酶活性在2小表现为上升外。其他受检测酶从检测所取的第一时间2小时开始，就处于较低水平，虽有波动，但均未达到对照组的FG细胞所检测的酶活性水平。其中ATPase受影响最严重，当60μg/mL吡虫啉作用2小时，ATPase活性较对照组的酶活性的抑制率高达60％。在体外毒性检测的细胞超微结构中观察到：线粒体是受损害最明显的细胞器。这一现象提示我们线粒体是其主要的作用靶位。对吡虫啉和啶虫眯暴露组的FG细胞进行DNA的提取和检测。发现在吡虫啉60μg/mL作用2小时的FG细胞的DNA检测中，出现明显的“DNAladder”现象。因此，提示烟碱类杀虫剂除直接作用于AChE受体外，还可以引起细胞的凋亡。这是首次发现吡虫啉可以引起细胞凋亡的发生。但在啶虫眯暴露组提取的DNA进行电泳检测时，却没有观察到降解DNA所形成的“梯形”带。
以上对毒性作用机理的研究可以说明：SOD、GSH-Px和ATPase对保护细胞免受氧化还原作用的伤害起着至关重要的作用。当SOD、GSH-Px和ATPase的活性降低时，其对细胞抗氧化还原的保护作用降低，导致线粒体内活性氧(ReactiveOxygenSpecies，ROS)升高，使线粒体的DNA受损，而线粒体自身的损害又是导致细胞凋亡的直接原因。因而引起细胞调亡。
综上所述，海水鱼细胞系FG对有机锡化合物和烟碱类杀虫剂的反应是敏感的，且测试方法具有快速、简便和灵活等优点。因此，FG是一个理想的体外毒性分析系统。同时，通过检测海水鱼细胞系FG在毒物作用下抗氧化防御系统和ATPase等各种酶活性变化，以及它们对FG细胞DNA的损伤情况，可以较准确的预测该化合物的毒性作用机理。因此，我们可以认为牙鲆鱼鳃的永生细胞系FG同样是一个很好的毒性机理“探测系统”。
牙鲆鱼;体外细胞毒性;有机锡化合物;烟碱类杀虫剂;机锡化合物;细胞毒性;毒性机理;海洋生物学;毒理学
中国海洋大学
博士
海洋生物学
张士璀
2005
中文
Q915.862;S482.3;S481.1
107
2006-07-27（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）