我国养殖太平洋牡蛎中诺瓦克样病毒的检测及部分核酸序列的分析
诺瓦克样病毒(Norwalk-likeviruses，NLVs)是一组形态和生物学特征类似的无包膜的正的单链RNA病毒的统称。其形态微小，圆形，直径为26-35nm，属于杯状病毒科。根据病毒RNA聚合酶区或衣壳蛋白核苷酸和氨基酸序列的同源性比较，将NLVs分为3个基因组：基因Ⅰ组(代表株NV)、基因Ⅱ组(代表株SMA)、Sapporovirus。美国联邦疾病控制中心(CentersforDiseaseControlandPrevention，CDC)对1976-1980年腹泻流行的调查报告表明约有42％的胃肠炎暴发与NLVs有血清学联系。NLVs能耐受不良的外界环境、感染持续时间长，且仅10-100个病毒粒子就能引起感染，所以说它的危害性不可低估。我国1995年从患儿的粪便标本中发现了第一例NLVs。靖宇等人曾经应用免疫酶联技术从北京市医院门诊非细菌性腹泻病人的血清标本中检测到NLVs，广州也有生食NLVs污染的蟹肉引发的急性胃肠炎的报道，这都说明在我国NLVs是存在的。美国和日本已报道了大量由于生吃贝类食物而暴发的NLVs感染引起的流行性胃肠炎。我国是水产品大国，每年都养殖大量的贝壳类水产品，尤其牡蛎是我国第一大养殖贝类，产量居贝类首位。每年我国都会向日本等国出口大量的牡蛎，此外在我国江浙沿海地区，人民喜欢生食贝类等海产品。因而建立一种快速的检测方法，一方面可以避免疾病的发生，保护人们的健康，另一方面，也可以监控出口海产品的质量。
到目前为止国内还没有关于检测养殖牡蛎中诺瓦克样病毒存在情况的相关报道。本论文利用pH9.5的甘氨酸缓冲液性处理牡蛎匀浆液，PEG沉淀病毒粒子的方法对未知的是否污染有诺瓦克样病毒的牡蛎样品进行处理，并提取病毒RNA，进行RT-PCR法对37份牡蛎样品进行了检测，共检测到6个阳性样品。从2002年11月到2003年4月份这一期间内所采集的牡蛎样品中，分离出的NLVs最多，说明冬天为牡蛎污染NLVs的高峰期。对于其中的粪便阳性样品和牡蛎分离样品的PCR产物进行纯化、连接及转化，获取重组克隆并测序。重组质粒序列测定结果在NCBI上进行BLASTn序列比对发现这些病毒分离株均属于GⅡ型。且与GeneBank上的日本株的同源性较高(＞94％)。这说明了地理关系上较近的NLVs之间的同源性较高。这就为设计公共引物提供了基础。六个病毒株的RNA聚合酶区部分237个碱基序列之间的相似度为79.2％.其中粪便样品与日本牡蛎样品的相似度为77.0％，而与其他4个牡蛎样品的相似度较低，分别为56.7％、56.1％、57.3％和65.3％。日本牡蛎样品与本试验中的牡蛎样品之间的相似度略高于粪便样品，分别为72.4％、73.6％、73.0％和79.4％。而本试验中分离得到的四个病毒株之间的相似度为95.5％。尤其是1、3、5号样之间的相似度高达99.0％以上。由此我们推断从中国牡蛎样品中分离出的几个病毒株之间同源性高，可以认为是一种基因型的病毒。而与日本的病毒株之间存在较显著的差异，和粪便分离株之间存在明显差异。粪便分离株、日本牡蛎分离株和中国牡蛎分离株之间RNA聚合酶部分序列的差异性也说明了NLVs在遗传上的多样性。其中日本牡蛎分离株与Lordsdalevirus(X86557)在遗传上比较接近；中国的4个牡蛎分离株与Mexicovirus(U22498)在遗传上比较接近。
为了进一步验证RT-PCR的试验结果，我们又进行了寡核苷酸探针杂交试验。根据已发表的NLVs的RNA聚合酶区的序列设计了一条生物素标记的寡核苷酸探针。用该探针对我们的病毒分离株的RT-PCR产物和插入有这些产物片段的质粒菌进行杂交试验，结果与RT-PCR一致。通过寡核苷酸探针杂交试验，我们可以不用再做克隆、测序和序列比对工作，就可以验证RT-PCR的结果，排除假阳性的结果。这对于只做一般样品检测的工场和实验室，尤其是对于大批量样品检测来说，在确保结果的正确性的基础上节省了开支和时间。
因为NLVs至今仍无法通过细胞培养法在实验室进行培养，所以无法通过一般常用的方法进行定量分析。我们建立了一个基于RT-PCR的检测诺瓦克样病毒的定量分析试验方法。通过该试验我们分别建立了针对NLVGI和NLVsGⅡ进行定量分析的标准曲线。该方法非常灵敏，其检测极限均为1.0×102拷贝数。根据NLVGⅡ的标准曲线，我们估计分离的原始病毒RNA的拷贝数为2.8×109、3.9×108和1.6×102。
诺瓦克病样病毒;反转录PCR;核酸序列;斑点杂交;荧光定量
中国海洋大学
硕士
海洋生物学
薛长湖
2005
中文
S944.41
64
2006-07-27（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）