真鲷（Pagrosomus major）精液超低温保存及其低温损伤研究
鱼类精液的超低温保存在鱼类养殖、遗传育种以及种质资源保存都具有重要的意义。鱼类精液的超低温保存可以使种质的长距离运输得以实现，同时有利于鱼类的杂交、选育、优良的形状的获得以及基因多样性的保护，而且鱼类精液冷冻库的建立可以为水产养殖业和试验生物学研究长期稳定地提供材料。自从50年前Blaxter成功冷冻保存大西洋鲱鱼精巢以来，鱼类精液的超低温保存取得很大的进展。目前已经有200多种淡水鱼类的精液，40多种海水鱼类的精液成功的获得保存，然而对于所有的硬骨鱼类的精液的超低温保存还没有得到一个统一的方法，鱼类精液的超低温保存技术有待于进一步的发展。
真鲷为我国、日本及韩国重要海水养殖鱼种，具有较高地经济价值，然而最近几年，由于过渡捕捞、海洋污染、以及栖息环境的改变导致真鲷资源量下降，因此，建立真鲷精液超低温保存的可靠方法对海水养殖业的发展以及生物多样性的保护具有重要意义。
本文采用2-mL的冷存管和程序降温法超低温保存真鲷精液。共实验了六种稀释液(Cortland、Hank'sbalancedsaltsolution、ModifiedMounib'smedium、Mounib'smedium、Mounib'sNaClmedium、Ringer)，六种抗冻剂(二甲基亚砜、二甲基乙酰胺、丙二醇、乙二醇、甲醇、甘油)，四种降温速率(10、20、30、40℃/min)，和三种解冻温度(35、40、45℃)对真鲷精液超低温保存效果的影响。将超低温保存前后精子的活动率，受精率和孵化率的变化作为筛选真鲷精液超低温保存方法的指标。试验结果表明，采用Cortland作为稀释液，15％-20％二甲基亚砜，9％和12％乙二醇，20℃/min的降温速率对精液进行超低温保存，液氮保存1周后，40℃水浴解冻，获得理想的活动率(79.4±4.7to88.6±8.0％)，受精率(89.6±2.9to95.6±1.9％)以及孵化率(85.3％±5.1％to91.4±4.3％)，而且与新鲜精液相比，超低温保存后的精液对胚胎发育的影响不大。采用此方法超低温保存的真鲷精液在受精率和孵化率上均获得了接近于新鲜精液的水平，因此，此方法可大规模应用于水产养殖业以及鱼类种质资源的长期保存和生物多样性的保护。
本文对保存1周后的精液从生理活性及形态结构方面分析了超低温保存对精子的损伤。通过电脑辅助分析系统分析超低温保存后精子的运动活力。发现超低温保存过程对精子的运动方式及快速运动的精子的运动速度基本无影响，但激活后其活力维持的时间与鲜精比较显著的缩短。鲜精激活后150s精子平均运动率从86.7±4.9％降至60.7±8.6％，而Cortland稀释液稀释的15％DMSO超低温保存的精液激活后其运动率从80.4±5.8％降至10.7±9.4％。经Cortland稀释液稀释的15％DMSO超低温保存的精液，电镜观察发现约50％-70％的精子保持正常的形态结构，10％-20％的精子的质膜、核膜或线粒体发生不同程度的膨胀和破裂，而有约10％-20％精子遭受了较严重的损伤，质膜完全破裂，只发现细胞核、线粒体和尾部结构。罗丹明123(Rh123)，碘化丙锭(PI)荧光双染色流式细胞观察近一步确定了15％DMSO对真鲷精液良好的保护效果，74.8％精子保持完整的膜结构和线粒体的正常功能。
除此之外，保存时间对真鲷精液质量的影响也进行了初步得探索。长期保存显著的降低了冻精的质量，同时DMSO的浓度对冻精受精率和孵化率也有显著的影响。有关长期保存对冻精质量的影响需要进一步跟踪研究。
真鲷;超低温保存;超微结构;低温损伤;CASA;FCM;长期保存
中国海洋大学
硕士
海洋生物学
张士璀;李军
2005
中文
Q959.483
65
2006-07-27（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）