螺旋藻/节旋藻原生质球制备和RAPD分析研究
原生质体(球)是生理研究和遗传育种的良好材料，原生质球的制备在节旋藻基因工程中也是不可缺少的实验手段。本论文论述了钝顶节旋藻FACHB341原生质球的制备方法，对已有的制备钝顶节旋藻原生质球的方法进行了改进。文中探索了节旋藻原生质球制备的最佳去鞘方法、缓冲液最佳pH值、最佳渗透稳定剂、最佳的酶组合以及溶菌酶的最佳浓度和酶解时间。实验结果证明，制备钝顶节旋藻原生质球需要将超声波法、离子法和酶解法相结合，其有利组合如下：取对数期的钝顶节旋藻FACHB341培养液，置于50mL离心管中进行超声波处理，能量为：3～5W，超声处理1.0s，间歇0.5s，处理2min。3000r/min离心10min，收集沉淀，置于含1.0～1.5mol/LNaCl的Zarrouk培养基中洗涤5min。3000r/min离心10min，收集沉淀，用无菌Zarrouk培养基洗涤2～3遍，3000r/min离心10min，收集沉淀。沉淀转入酶解液中。酶液组成为：0.2mol/L磷酸钾缓冲液pH7.2，渗透稳定剂KCl0.8mol/L，0.5％溶菌酶。在28℃～30℃水浴低速震荡下酶解5～7小时，低渗爆破法检测原生质球，显微镜下计数细胞总数，经伊文思兰染色液活体染色每隔1.5小时计数原生质球数目，得出活体原生质球得率。此方法可以得到40％以上有活性的钝顶节旋藻原生质球，为节旋藻的进一步遗传转化以及基因工程研究提供了实验基础。
同时本研究对本实验室保存的9株螺旋藻和节旋藻品系：钝顶节旋藻FACHB341、FACHB438、FACHB439、FACHB793、FACHBJP1、OUQDS6、OUQDS8，极大节旋藻OUQDSM和螺旋藻FACHB351进行了随机扩增多态性DNA研究。为得到一个稳定的RAPD反应体系，首先对影响反应体系稳定性的主要因子进行了优化，优化结果为：在25μL反应体系中DNA模板用量50ng，Mg2+浓度2.5mmol/L，引物浓度为2μmol/L，10mMdNTP1μL，Taq聚合酶1U。反应程序：94℃预变性10min，然后94℃1min，36℃1min，72℃2min，40个循环，最后72℃下延伸10min。电泳条带按照Nei-Li法公式S=2Nxy/(Nx+Ny)获得各样品间的相似性，再用D=1-S获得相应的遗传距离，应用Phylip软件包分析，按UPGMA法构建聚类分析图。其结果如下：
(1)对60个随机引物进行筛选，其中有15个引物重复性好，条带清晰，多态性高。15个引物在9个品系总计扩增出140条条带，平均每个引物扩增出9.3条，其中多态性条带为139条，占99％以上。
(2)通过品系间遗传距离发现，各品系间遗传距离最远的是FACHB351和OUQDS8，为0.1925，遗传距离最近的是FACHBJP1和FACHB793，为0.0793，9株藻的遗传距离从总体上看都相距较近，说明它们的遗传背景较为相似，这也与它们的分类地位较一致。
(3)从聚类图上看出，9株品系首先聚为三类，其中FACHB351为第Ⅰ类，FACHB341为第Ⅱ类，其他7株聚为一类属第Ⅲ类；第ⅢⅡ类又分为两支，FACHB439单独为一支，FACHB438和其余5株聚为另外一支；其中FACHB793和FACHBJP1、OUQDS8和OUQDSM的遗传距离最为接近，二者各属于同一分支。
上述分类结果与9个品系的某些生理生化和分子生物学特性相吻合，但与依据藻丝体显微形态特征的经典分类有出入，因此，尽快在分子水平上建立合理、有效的螺旋藻/节旋藻分类及新品种(系)鉴定方法，具有十分重要的理论与实际意义。
螺旋藻;节旋藻;原生质球;分子生物学;遗传距离;基因工程
中国海洋大学
硕士
遗传学
张学成
2005
中文
Q949.203
63
2006-07-27（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）