家兔（Oryctolagus curiculus）角膜内皮细胞系的建立及其生物相容性研究
角膜内皮盲是一种常见的角膜病，尽管可以通过角膜移植来治愈，但由于角膜的捐献数量极其有限和患者的排斥反应而使许多患者无法重见光明。人工角膜组织工程技术是当今治疗角膜内皮盲等的研究热点，其亟需解决的关键问题之一是如何获得足量的角膜内皮细胞。而角膜内皮细胞的规模化体外培养是获得大量角膜内皮细胞的理想途径，也是人工角膜的重要研究内容之一，对于角膜病理生理学、药理毒理学、免疫学、分子生物学研究均具有重要意义。但到目前为止，仍没见到有关家兔角膜内皮细胞未经转染而成功建系的报道。为了探索哺乳动物角膜内皮细胞的建系技术，以便为组织工程化人工角膜提供足量的细胞材料，本文以家兔角膜内皮为材料，对角膜内皮细胞的体外培养、细胞系的建立及其鉴定展开了研究。
为了成功启动家兔角膜内皮细胞的体外培养，本文取活家兔的角膜，用氯化汞溶液和庆大霉素依次进行消毒，经0.25％胰蛋白酶液部分处理角膜内皮层后，将角膜内皮面朝下贴于24孔培养板中，补加含有硫酸软骨素、硫酸软骨素氧化降解物、羧甲基壳多糖、N-乙酰葡萄糖盐酸盐、氨基葡萄糖盐酸盐、家兔角膜基质细胞培养液、牛眼生素、EGF和bFGF的DMEM-F12培养液(20％胎牛血清)，置入37℃、5％CO2培养箱中培养。为了获得纯净的角膜内皮细胞，每隔12～48小时进行揭膜和转孔再培养，进而成功启动了家兔角膜内皮细胞的原代培养。原代培养中的角膜内皮细胞多为四角形或多边形，一周后逐渐伸展成为多角形的内皮样，三周后细胞长成单层，此时细胞饱满、透光性好。待角膜内皮细胞长成单层后，便采用胰蛋白酶消化法进行传代培养。传代培养中的细胞，开始时绝大多数为多角形内皮样形态，但随着传代次数增加，逐渐转变为内皮样与成纤维样两种细胞形态共存的生长状态。传至第49代的角膜内皮细胞，主要呈现为成纤维样细胞形态，其生长与分裂状况良好。此时，细胞群体的倍增时间为2.24天，贴壁生长的前2天为迟缓期，第3～5天为对数生长期，第6天为平稳期，第7天便开始衰退。染色体标本制作的实验结果显示，绝大多数角膜内皮细胞的染色体数目为44条，但出现了染色体数目的非整倍性，染色体数目的分布范围在29～48条之间，其中44条的细胞占总细胞的44.2％。此外，本文还确立了家兔角膜内皮细胞的冻存步骤和复苏步骤，经此方法保存的细胞在形态上和生长状况上与之前无明显差异。目前，角膜内皮细胞已传至62代，生长与分裂状况依然良好。
寻找或研制出具有良好的生物相容性、在体内具有与角膜内皮细胞生长相匹配的降解性的生物膜材料是解决角膜细胞移植问题的关键技术。壳聚糖是一种天然存在的聚阳离子生物多糖，由于结构上类似人体内的硫酸软骨素、透明质酸等物质，在体内具有良好的生物降解性和生物相容性。本文以不同类型的壳聚糖生物膜为支架，观察家兔角膜内皮细胞在膜上的生长情况，研究不同类型壳聚糖膜与角膜内皮细胞的生物相容性。结果显示，家兔角膜内皮细胞在631ha、4＃ha、631s三种壳聚糖生物膜上均能进行生长，但有不同程度的聚集和脱膜现象。其中，细胞在631s壳聚糖生物膜上能生长形成细胞单层，只有轻微的聚集和脱膜现象，提示631s膜片经过改良后有望成为理想的角膜内皮细胞载体膜。
家兔角膜内皮细胞系的建立研究，及与壳聚糖生物膜的相容性研究，对人等哺乳动物角膜内皮细胞系的建立具有重要的指导价值，为角膜组织工程技术及其临床应用奠定了基础。
角膜内皮细胞;细胞系;壳聚糖生物膜;角膜组织工程;角膜内皮盲;生物相容性
中国海洋大学
硕士
细胞生物
樊廷俊
2005
中文
R318.18;R779.65;Q813
57
2006-07-27（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）