恩诺沙星抗体制备及免疫检测方法的初步研究
恩诺沙星(Enrofloxacin，EF)是一种动物专用的氟喹诺酮类(Fluoroquinolone，FQs)药物，为人工合成的新型广谱杀菌性抗菌药物，广泛用于水产及畜禽养殖，已经成为我国目前常用的渔药和兽药之一。近年来关于FQs药物临床应用时所产生的耐药性、残留毒性以及不良反应的报道越来越多，食品中相应残留的检测也愈加引起人们的重视。
目前，对FQs药物残留的检测方法主要是色谱法，但更为简便、快速的筛选检测方法则较为缺乏。从近年来食品中化学污染物检测技术的发展趋势来看，免疫分析法是最有前途的药残快速检测方法之一。
本研究旨在研究EF完全抗原的合成与鉴定方法，并在所制备多克隆抗体(Polyclonalantibodies，PcAbs)的基础上，初步建立一种间接竞争酶联免疫吸附法(Indirectcompetitiveenzyme-1inkedimmunosorbentassays，Ci-ELISA)，以检测动物可食组织中EF残留。实验分为三部分：第一部分为EF完全抗原合成及鉴定。包括载体蛋白的封闭；比较碳二亚胺法和活化酯法二种合成方法对完全抗原合成地影响；利用正交实验对合成过程的主要因素进行优化；采用紫外图谱、偶联比、抗体效价以及基质辅助激光解吸与离子化时间飞行质谱对偶联情况进行鉴定。第二部分为抗体的制备与鉴定。完全抗原免疫BALB/C小鼠获得抗体，测定抗体的效价并检测其特异性。第三部分初步建立Ci-ELISA方法检测样品中EF残留情况，并对方法的准确度和灵敏度等指标进行了评价，检测结果均经HPLC方法确证。实验结果如下：
1.实验首次采用乙二胺(Ethyldiamine，EDA)对载体蛋白进行封闭处理，从紫外图谱以及抗体效价结果可以看出，封闭可以明显提高完全抗原的合成效果。
2.正交实验结果表明：在载体蛋白、偶联时间和EF与载体蛋白的摩尔比三因素中，载体蛋白具有较为明显的影响，其中鸡血清白蛋白(Ovalbumin，OVA)的效果最好；较好的EF与载体蛋白的摩尔比为75：1，较好的偶联时间为24h。
3.不同的合成方法对不同载体蛋白合成完全抗原的性能具有一定影响。从偶联比和效价的结果来看，OVA采用活化酯法效果较好，而牛血清白蛋白(Bovineserumalbumin，BSA)采用碳二亚胺法得到的血清效价较高。
4.酶联免疫吸附法(Enzyme-linkedimmunosorbentassays，ELISA)测定抗体的效价，以BSA为载体的完全抗原产生的抗体效价可达1：250000，以OVA为载体的完全抗原效价高达1：300000。选择四种EF结构类似物，四种其他族抗生素做抗体的竞争抑制率，结果表明：不论以何种蛋白为载体的完全抗原产生的抗体对四种其它族抗生素的抑制率均＜0.01％，而对四种结构类似物的抑制率分别为14.2％～161.7％，1.3％～169.8％。
5.Ci-ELISA方法的最低检测限(Limitofdetection，LOD)为1ng/mL，线性范围为1ng/mL～1000ng/mL。孔间变异系数为9.8％～17.4％，批间变异系数为11.9％～23.4％，添加回收率在60.07％～120.8％。
6.实际样品中EF残留检测表明，Ci-ELISA方法和HPLC方法的检测结果具有良好的相关性。
目前，针对食品中FQs类兽药残留，免疫检测方法及技术较少有研究涉及；而关于该类小分子药物，完全抗原合成条件、鉴定方法及其对偶联效果和抗体性能的影响，以及完全抗原合成过程的主要工艺因素的优化研究，尚未见报道。本实验的研究成果能够为EF的免疫检测提供基础和依据，对于今后FQs类药物快速检测技术及相关产品的研究也具有一定参考价值。
恩诺沙星;食品卫生;卫生检验;抗体;药物代谢动力学
中国海洋大学
硕士
食品科学
林洪
2005
中文
TS207.5
62
2006-07-27（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）