白斑综合症病毒（WSSV）VAP1基因在酵母双杂交系统中的应用及对虾鳃膜蛋白P53的初步研究
对虾白斑综合症病毒(WSSV)是对虾暴发性流行病的主要病原，严重危害对虾养殖业。病毒入侵宿主首先要和靶细胞上对应的特异性受体结合，然后在宿主细胞内大量增殖。深入了解WSSV的感染机制，找到编码受体蛋白的基因，无疑对病害的防治具有基础性意义。本实验把病毒粘附蛋白VAP1的基因进行改造后将其应用于酵母双杂交系统Ⅲ，以探索用于筛选与其相互作用的对虾基因的可行性。
VAP1是白斑综合症病毒(WSSV)囊膜上与宿主有结合活性的粘附蛋白之一，已证实它在酵母双杂交系统中作为诱饵蛋白时存在自激活活性。在其C-末端有一个大的跨膜疏水区，拟去除该跨膜疏水区，即把粘附蛋白VAP1的C-末端去除对应的34个氨基酸。在WSSV全基因组中，针对VAP1基因特定位点去除102个bp后，用PrimerPremier软件设计了一对引物，并引入NdeⅠ和PstⅠ酶切位点，PCR扩增后，酶切、纯化，并定向连接于载体pGBKT7，然后转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，提取转化菌的质粒后进行PCR以及双酶切鉴定，确定有重组子后进行测序，结果表明序列完全正确。提取重组质粒并分别转化AH109、Y187酵母感受态细胞，选择性培养基鉴定结果表明：表达的诱饵融合蛋白没有激活报告基因HIS3和ADE2，但激活了MEL1。可利用HIS3和ADE2这两种报告基因进行双杂交筛选。
用文库菌株AH109[cDNALibrary]和含融合质粒的菌株Y187[pGBKT7-VAP1]做酵母融合，经TDO、QDO缺陷型培养基筛选，并反复划线培养于QDO缺陷型培养基并结合PCR技术确定了一个阳性克隆。对PCR扩增得到的cDNA片段进行测序，其长度为649bp。以+2阅读框分析其核苷酸序列，该序列从终止密码子(TAA)之前即为一个开放阅读框(ORF)，这可能即为该段DNA所编码的蛋白。将该cDNA片段于NCBI中经BLASTP同源性比较分析，结果表明其表达的蛋白与一未命名蛋白产物(Unnamedproteinproduct)的同源性最高为59％，与蛋白酶的同源性为38％，与Cellwallmannoprotein,acceptorofB1-6glucan的同源性为26％.从病毒与鳃膜蛋白的特异性结合推测该蛋白很可能是一种蛋白酶，它与病毒粘附蛋白的结合类似于酶与底物的结合，具有高度的专一7性。该基因片段为研究WSSV入侵宿主以及致病机制提供了一定的线索。由于所分析的插入片段只有部分序列，下一步应克隆全长基因片段并进行表达以做更深入的研究分析。
对虾的鳃组织是WSSV的靶器官，在对虾鳃膜蛋白中必定存在与病毒结合的受体蛋白，研究对虾鳃膜蛋白对探究病毒与受体相互作用机制具有重要意义。本实验室已经通过ELISA方法证实P53对虾鳃膜蛋白与WSSV有结合活性。本研究对P53对虾鳃膜蛋白进行了MALDI-TOF-MS-MS质谱测序，并且经BLASTP对其保守域进行了功能分析。
本研究首次把VAP1基因进行改造，并利用酵母双杂交技术筛选与之相互作用蛋白的基因，对研究WSSV病毒的受体蛋白具有开拓性意义。通过生物信息学方法分析该基因表达的蛋白与蛋白酶的同源性较高也是一创新性的发现。P53鳃膜蛋白通过质谱测序后分析其与ATPsynthaseβ-Subunit具有高度的同源性，该蛋白的功能与活性还有待于下一步的克隆与表达分析。
白斑综合症病毒;WSSV;酵母双杂交系统;鳃膜蛋白;对虾;虾病;虾类养殖
中国海洋大学
硕士
海洋生物学
黄倢;戴继勋
2005
中文
S945.4
106
2006-07-27（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）