日本（虫寻）（Charybdis japonica）血蓝蛋白的分离纯化及其酚氧化酶样生物化学性质的研究
血蓝蛋白(hemocyanin，Hc)是在软体动物和节肢动物血淋巴中发现的存在于细胞外、负责运输氧的一类巨大蛋白质。很多研究表明，软体动物及节肢动物的Hc与酚氧化酶(phenoloxidase，PO)虽然功能迥异，但在结构上均具有Cu2+结合位点，且在特定的条件下，Hc又能转化为酚氧化酶样酶
(hemocyanin-derivedphenoloxidase，HdPO)而表现出PO活性。对Hc的分离纯化及其HdPO的生化性质研究，不仅对于查清特定条件下Hc在无脊椎动物非特异性免疫系统中的作用具有重要意义，而且还有助于我们对Hc肩负多重生物学功能的认知。为了揭示甲壳动物Hc的HdPO生物化学性质，本文以日本(虫寻)的血淋巴为实验材料，利用sephacrylS-100凝胶过滤柱层析DEAEsepharoseFastFlow离子交换柱层析技术对日本(虫寻)的Hc进行了分离纯化，并以L-二羟苯丙氨酸(L-DOPA)为特异性底物对其HdPO生物化学性质进行了系统研究。实验结果表明，本文所获得的A340/A280比值为0.21的日本(虫寻)Hc纯化样品，在SDS-PAGE(十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)中显示为分子量分别为74.3kDa和69.1kDa的两条带，与酚氧化酶原(pro-phenoloxidase，proPO)和PO的分子量大小不同，说明本实验纯化得到的Hc没有被proPO或PO污染。综合Hc在柱层析洗脱峰的分布和SDS-PAGE电泳图谱等方面与proPO及PO的差别，证明本文所得纯化样品确为Hc。利用体外激活剂对日本(虫寻)Hc的激活结果显示，0.1％SDS能非常有效地将Hc转化为HdPO，异丙醇和胰蛋白酶只能部分将Hc激活为HdPO，而尿素对Hc的激活作用很弱。为此，本文选用0.1％SDS来激活Hc纯品使之成为HdPO，并以L-二羟苯丙氨酸(L-DOPA)为特异性底物对其HdPO生物化学性质进行了研究。研究结果表明，HdPO对L-DOPA底物的最适反应pH值约为7.0，最适温度约为40℃，Km值约为2.90mmol/L。底物特异性研究还发现，此HdPO不仅对L-DOPA具有氧化活性，对酪氨酸底物也具有氧化活性，且对酪氨酸的Km值约为7.33mmol/L，但不能氧化对苯二酚和邻苯二酚，说明该酶不仅对L-DOPA(二酚)具有氧化活性，而且对酪氨酸(单酚)也有氧化活性，但对二酚的亲合力要高于单酚。此研究结果表明，这种HdPO很可能是一种酪氨酸酶类型的PO，而不是漆酶或儿茶酚酶。利用多种氧化酶特异性抑制剂对HdPO酶活性影响的研究结果发现，日本(虫寻)HdPO对于酪氨酸酶的特异性抑制剂半胱氨酸(cysteine)、苯硫脲(phenylthiourea)和抗坏血酸(ascorbicacid)非常敏感，对硫脲(thiourea)和亚硫酸钠(sodiumsulfite)比较敏感，而对苯甲酸(benzoicacid)和柠檬酸(citricacid)不敏感，从而进一步证明了日本(虫寻)HdPO确为一种酪氨酸酶类型的PO。此外，HdPO对金属离子螯合剂乙二胺四乙酸(EDTA)、二乙基二硫氨基甲酸酯(DETC)以及金属离子非常敏感，其酶活性能被EDTA、DETC和Cu2+强烈抑制，且10mmol/LCu2+能完全回复被EDTA抑制的酶活性，说明日本(虫寻)的HdPO与其PO一样也是一种铜金属酶(Cu-metalloenzyme)，从而证实日本(虫寻)Hc也是一类含铜蛋白(copper-containingprotein)，从而也使我们更容易理解Hc在特定条件下可以转化为HdPO、在非特异性免疫中行使与PO相似的免疫学功能。
日本(虫寻);血蓝蛋白;酚氧化酶;酚氧化酶样酶;酪氨酸酶;金属酶;生物化学
中国海洋大学
硕士
细胞生物
樊廷俊
2005
中文
Q959.21;Q516;Q554.9
56
2006-07-27（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）