重组β-琼胶酶的制备与应用

李京宝

中国海洋大学

摘要：

随着糖生物学研究的开展,寡糖的重要生理活性和药用价值逐渐被人们所发现,而琼胶寡糖的抗肿瘤、抗炎、抗氧化等作用备受关注,有望成为新一代的海洋药物和功能食品.在琼胶寡糖制备方面,酶解法较其他方法有着底物专一性强、产物特异性高、反应条件温和等优点,有利于高纯度寡糖的大量制备.因此,高效琼胶酶的发现与规模化制备具有重要理论意义和明确的应用前景.该论文旨在建立两种高活力、高特异性的β-琼胶酶AgaA和AgaB大规模制备的技术平台,并利用这两种酶制备系列高纯度新琼寡糖.主要研究内容如下:1.转基因菌株最佳产酶条件的建立.通过设计了L<,9>(3<'4>)正交试验,从诱导温度、诱导时间、IPTG浓度、DOC浓度四个方面对产β-琼胶酶的转基因工程菌株BL21-pET24-agaA和BL21-pET24-agaB的表达条件分别进行了优化,最终确定BL21-pET24-agaA的最佳产酶条件为25℃,16h,0.1mM IPTG,0.01﹪mM IPTG,0.001﹪ DOC,发酵液酶活性提高5.3倍;BL21-pET24-agaB的最佳产酶条件为25℃,24h,0.1mM IPTG,0.001﹪ DOC发酵液酶活性提高近10倍.2.琼胶酶的分离纯化.在优化了表达条件的基础上,利用快速蛋白质液相色谱纯化系统(FPLC)对两种β-琼胶酶分别进行了纯化.3.系列高纯度新琼寡糖的制备.利用纯化的两种琼胶酶分别建立了高产不同聚合度新琼寡糖的最佳琼脂糖酶解体系.4.系列新琼寡糖的结构确证.在得到纯度较高单体的基础上,又利用基质辅助激光解吸-飞行时间质谱(MALDITOF-MS)、红外光谱(IR)和核磁共振碳谱(<'13>C-NMR)对系列新琼寡糖进行了结构的确证.该论文建立了两种β-琼胶酶的制备工艺,并利用这两种酶建立了系列高纯度新琼寡糖制备的技术平台,解决了新琼寡糖制备的技术难题,实现了系列高纯度新琼寡糖的大规模制备,为海洋寡糖类创新药物、功能食品等生物制品的研究与开发奠定了基础;并首次提供了新琼八糖、十糖和十二糖标准品,填补国际市场上的空白.

关键词：表达;β-琼胶酶;蛋白纯化;新琼寡糖

授予单位：中国海洋大学

授予学位：硕士

学科专业：生药学

导师姓名：于文功

学位年度：2004

语种：中文

分类号：R915

页数：51

在线出版日期：2005-05-24（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）