黑鲷肿瘤坏死因子cDNA的克隆与体外表达的研究

高春萍

中国海洋大学

摘要：

肿瘤坏死因子(TNFα)是一种具有广谱生物学活性的细胞因子,在不影响正常细胞的前提下,于体内外均能杀伤肿瘤细胞并抑制肿瘤细胞的增殖;并且可以通过刺激T细胞,诱导MHC的表达,参与和调控机体的免疫应答、炎症及发热反应[Camussi,1991].该研究采用同源克隆的方法,从黑鲷cDNA中获得肿瘤坏死因子(TNFα)全长cDNA序列.该序列含1288核苷酸,可编码253个氨基酸的TNF前体蛋白.它是一种跨膜蛋白,无糖基化位点和信号肽结构.黑鲷TNFα与其它鱼类的TNFα的相似性很高,与其它鱼类TNFα占据进化上独立的分支,与哺乳类TNFα和TNFβ源于共同的祖先.基因结构分析显示,该基因含有TNF家族profile和TNF家族的标签序列;在参与TNFα基因二硫键形成的两个半胱氨酸和TNFα三聚体形成的位点高度保守;空间结构模拟显示,它与哺乳类TNFα的空间结构相似,都是由两个β折叠片组成,每个折叠片包含五个反向平行的β链.表达研究结果表明,黑鲷TNFα在检测的各个组织中均为组成型表达,表现为在刺激与非刺激鱼体中,都可以检测到黑鲷TNFα的表达,但是其表达水平在不同组织中有很大差异.黑鲷TNFα在头肾、脾脏和鳃的表达量较高,而在心脏、肝脏、血液、肾脏和大脑中表达量较低.为进一步研究黑鲷肿瘤坏死因子的生物学功能,将黑鲷肿瘤坏死因子(TNFα)基因的成熟肽区域亚克隆到表达载体pQE30中,并转化到大肠杆菌XL1-blue中进行表达.转化子经载体和基因特异性引物进行PCR双向筛选,并将筛选到的阳性克隆经质粒纯化后,进行序列测定.序列测定结果显示,该基因结构正确,且准确地插入到表达载体启动子的下游,获得了结构和组成正确的重组子.重组子经IPTG诱导后,以SDS-PAGE电泳鉴定,电泳结果表明,该基因在大肠杆菌XL1-blue中实现了表达.不同诱导时间对重组蛋白影响实验显示,随诱导时间的增加,重组蛋白产量逐渐增高,经4h诱导,其表达量可以达到平台期,继续培养,rTNFα的表达并不显著增高.重组蛋白经镍金属亲和层析纯化,获得了纯度较高的重组蛋白.采用交换缓冲液的方法,用Sephadex G150,对重组蛋白进行脱盐复性,使重组蛋白得到了进一步纯化.同时,可溶性的rTNF重组蛋白也可在自然条件下进行纯化.

关键词：黑鲷(Acanthopagrus schlegeli);肿瘤坏死因子α(TNFα);分子克隆;特征分析;重组

授予单位：中国海洋大学

授予学位：硕士

学科专业：海洋生物学

导师姓名：池振明;宋林生

学位年度：2004

语种：中文

分类号：Q178.53;Q78

页数：54

在线出版日期：2005-05-24（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）