真鲷抗菌肽基因重组表达载体的构建及其在酵母中的表达
抗菌肽是具有抗菌活性的短肽的总称,广泛存在于生物界.这种内源性的抗菌肽经诱导而合成.在机体抵抗病原菌的侵入方面起着重要作用,更被认为是缺乏特异性免疫功能生物的重要防御成分.该研究主要构建了真鲷抗菌肽基因Hepcidin和Pleurocidin的酵母表达载体,并且在甲醇营养型酵母巴氏毕赤酵母Pichia pastoris中表达出重组Hepcidin,通过抑菌活性的检验和SDS-PAGE验证了所表达的蛋白质.通过对中国海产名贵经济鱼类真鲷(Pagrus major)抗菌肽基因的扩增,分别得到Hepcidin基因100bp左右和Pleurocidin基因100bp左右的成熟肽片段.首先获得纯度较高的含目的基因的载体,随后对PCR反应条件进行了分析,得到清晰的目的条带.大量扩增后进行初步的浓缩纯化,将PCR产物和酵母表达载体均用xho Ⅰ和xba Ⅰ双酶切,最后用粘端连接的方法过夜充分连接.经过酶切检验和PCR鉴定,筛选出阳性重组酵母表达载体,为重组表达奠定了基础.酵母的转化需要大量的DNA,所以先将重组表达载体大量制备,用载体单一性的酶sac Ⅰ进行消化后,采用电穿孔法进行重组载体的转化,设立浓度剃度涂步平板,以期获得更多更好的单菌落.酵母的生长温度较细菌低,介入28-30℃之间.将平板于30℃青静置培养3-7天.挑取单菌落进行培养.提取酵母基因组DNA进行PCR鉴定.同时还对转化子的表型进行鉴定,以筛除假阳性.由于存在转化位点、方式和目的基因拷贝数等许多不稳定因素,将获得的所有阳性菌株分别进行诱导培养,将培养液上清超滤浓缩.由于抗菌肽片段较小,PAGE电泳时采用三层胶,而且电泳时间较短,可以获得较清晰的条带,从而筛出可以表达目的条带的菌株,从而进行大量诱导.将诱导表达的上清液进行抗菌活性的检测.该实验主要检验了重组hepcidin对大肠杆菌和鳗弧菌的抑制效果.结果表明:重组抗菌肽Hepcidin对大肠杆菌有一定的抑制作用,对鳗弧菌没有明显的效果.
真鲷;巴氏毕赤酵母;表达载体;重组表达;抗菌肽;转化;抑菌活性
中国海洋大学
硕士
水生生物学
陈松林;孙世春
2004
中文
S965.231
65
2005-05-24（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）