条斑紫菜的转基因研究
纯系培育是传统紫菜育种及进行紫菜生物工程研究的先决条件.该研究选取青岛地区野生条斑紫菜(Porphyra yezoensis),利用酶解制备原生质体进行再培养的方法培育了营养体纯系PY-qingdaol.对PY-qingdaol的18S rRNA基因进行了克隆和序列测定.将该基因与从GenBank获得的22个紫菜进行了分析、比较,并以相邻连接法构建了紫菜较为一致的系统发生树.结果表明利用紫菜18S rDNA基因序列差异可较精确的进行紫菜种间乃至品系的划分,这为进行紫菜的种质鉴定提供了一个新的思路.为确立电击法转化条斑紫菜原生质体的条件、确定有效的启动子并验证以18S rDNA为外源基因整合位点的可行性,构建了以条斑紫菜18S rDNA片段为同源臂、CaMV35S为启动子、GUS基因为报告基因的同源重组型表达载体,并利用电击法对外源GUS基因在条斑紫菜原生质体瞬间表达进行了初步探索.为确定合适的选择性标记基因,以条斑紫菜18S rDNA片段为同源臂,构建了分别利用SV40启动子和CaMV35S启动子的两种cat基因的同源重组型表达载体pQD-CAT-control和pQD-CAT-Enhancer.利用电击法将所构建的表达载体转化条斑紫菜原生质体.结果表明,SV40启动子和CaMV35S启动子均可以驱动cat基因在条斑紫菜原生质体中有效表达;所构建的以18S rDNA片段为同源臂的两种同源重组型载体均可实现cat基因在条斑紫菜原生质体中的稳定表达;当以cat基因作为选择性标记基因时,氯霉素可以作为紫菜原生质体基因转化的选择压力.对小鼠的TRAIL cDNA,进行了克隆和序列测定,并构建了以条斑紫菜18S rDNA片段为同源臂、cat基因为标记基因、TRAIL基因为外源基因、分别利用SV40启动子和CaMV35S启动子的同源重组型表达载体pQD-TRAIL-CAT.利用电击法将其转化条斑紫菜原生质体,经氯霉素初步筛选,检测到外源基因已整合到紫菜基因组中.进行了条斑紫菜原生质体的玻璃化冷冻保存研究,发现玻璃化保护剂VS6(10﹪ DMSO,30﹪甘油,10﹪蔗糖)的保存效果较好,其最佳冻存程序是:25﹪ VS6过渡处理5min后,用0℃预冷的VS6处理3min,直接液氮保存,化冻时采用40℃水浴快速化冻.按此方法,冷存后的原生质体的存活率可达66.5﹪,并且能再生成叶状体.总之,该研究初步建立了条斑紫菜原生质体的转基因体系,优化了电击法转化条斑紫菜原生质体的条件,确定了SV40启动子和CaMV35S启动子为有效的启动子,cat基因可以作为选择性标记基因,以18S rDNA片段为同源臂的同源重组型表达载体可以有效的表达外源基因.此外还首次成功地进行了条斑紫菜原生质体的玻璃化冷冻保存,不仅为藻类的种质保存研究积累了资料,也可以为以后紫菜原生质体的遗传转化操作随时提供理想的实验材料.
条斑紫菜;原生质体;转基因;同源重组;冷冻保存
中国海洋大学
博士
海洋生物学
戴继勋;于文功
2004
中文
S968.431
102
2005-05-24（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）