海洋弧菌Vibrio sp.QY101褐藻胶裂解酶的研究

宋凯

中国海洋大学

摘要：

该论文使用选择性广泛地筛选高产褐藻胶裂解酶的菌株,已发现50余株产酶菌株,其中菌株QY101同其它菌株相比,具有酶活高、降解速率快等特点,我们以它作为研究对象进行了该课题的研究工作.首先对菌株QY101进行了鉴定.菌种鉴定采用形态观察和生理生化反应以及16s rRNA技术,实验结果表明菌株QY101可以鉴定为弧菌属Vibrio,命名为Vibrio.sp.QY 101.其次,我们进行了Vibrio.sp.QY 101胞外褐藻胶裂解酶的分离纯化.在分离纯化过程中,我们发现除了目的收集组分外,尚有一个小的组分有活性,但由于含量低,难以分离纯化.在这种情况下,我们针对该组分更易降解poly (G)的特性,根据已知的褐藻胶裂解酶基因的同源性设计引物,使用简并PCR与反向PCR技术从Vibrio.sp.QY 101中克隆到一个褐藻胶裂解酶基因alyVI.基因序列分析发现alyVI由编码338个氨基酸的1014bp的开放阅读框组成,其编码的蛋白分子量为38.4kDa,其中包括分子量大约为4.4kDa的一段信号肽.利用pET24a(+)建立了alyVI的高效表达载体,并使用Ni<'2+>亲和柱分离得到AlyVI.酶学性质研究表明:AlyVI分子量约为34kDa,在1mM ZnCl<,2>存在的情况下,AlyVI的酶活最适温度为40℃,最适pH为7.5.序列分析表明,AlyVI含有"YXRSELREM",这9个氨基酸的保守序列仅仅存在于poly(G)活性的褐藻胶裂解酶中.该实验中得到的AlyVI同时具有poly(G)与poly(M)的活性,但是AlyVI对poly(G)的km比对poly(M)的km低一个数量级,说明这个保守序列可能与底物特异性有关.分子量与酶学性质表明AlyVI与层析技术分离纯化得到的褐藻胶裂解酶为两种不同的酶.

关键词：弧菌;褐藻胶裂解酶;菌种鉴定;分离纯化;克隆表达

授予单位：中国海洋大学

授予学位：博士

学科专业：水产品加工与贮藏工程

导师姓名：于文功

学位年度：2004

语种：中文

分类号：Q557.9

页数：100

在线出版日期：2005-05-24（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）