南极细菌Moritella sp.低温脂肪酶基因的克隆与表达

杨秀霞

中国海洋大学

摘要：

该研究从南极第18次科学考察所采水样中分离出500株低温细菌,对其进行低温脂肪酶筛选,得到120株产酶菌株,从中进一步筛选到5株酶活较高的细菌,进行产酶分析,发现皆为诱导产酶类型.随后对5株酶活较高的细菌进行了分子鉴定,通过16S rDNA序列的比较分析,菌株1-2-8-1、2-5-10-1、2-2-2-1应属于Moritella属,1-1-10-2属于假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas sp.),9-2属于嗜冷杆菌属(Psychrobacter sp.).由系统发育分析可见,该研究5株产低温脂肪酶的菌株均属于细菌域(Bacteria)中的紫细菌(Proteobacteria)类群中的γ-亚群.对菌株2-5-10-1酶性质研究发现,该酶具有典型的低温脂肪酶特性,显示出很好的应用前景.考虑到低温培养的局限性,我们对低温脂肪酶基因进行了中温宿主的克隆与表达研究.采用限制性内切酶Sau3AI酶切染色体DNA,洗脱2~9kb的DNA片段,然后与事先经BamHI酶切且去磷酸化的质粒载体pBluescript连接,导入大肠杆菌DH5α中,以此建立基因组DNA文库,产生18700个重组克隆,然后采用常规的透明圈法筛选目的克隆.培养条件为25℃培养至长出可见菌落,然后4℃培养4d,最终筛选到1个有显著透明圈的克隆.提取克隆质粒DNA并测序发现,该核苷酸序列包含完整的脂肪酸的可读框长837bp,编码279个氨基酸.该酶含有一个绝大多数脂肪酶都存在的以Ser为中心的共有特征序列和一个保守的His-Gly二肽.上游有关启动子的保守序列-10序列TAAATA和-35序列TATCCT以及SD序列AAGTG,说明此基因是靠自己的启动子在大肠杆菌中得到了表达.酶活研究发现,重组的脂肪酶基因表达出明显的低温活性.借助不同的网络服务器和生物学软件,对低温脂肪酶基因进行了蛋白质一级结构解析,二级结构预测等项分析,探讨了低温脂肪酸的结构与功能.

关键词：嗜冷菌;Moritella sp.;低温脂肪酶;DNA序列

授予单位：中国海洋大学

授予学位：博士

学科专业：渔业资源

导师姓名：陈大刚;黄晓航

学位年度：2004

语种：中文

分类号：Q939.1

页数：120

在线出版日期：2005-05-24（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）