半滑舌鳎HH信号通路相关基因的克隆表达及功能分析
半滑舌鳎（Cynoglossus semilaevis）是我国北方重要的海产经济鱼类之一，它味道鲜美，适应性强，雌性生长速度是雄性的2-3倍，因此了解半滑舌鳎的性腺分化与发生，攻克性别决定机制对单性育种、提高育种质量等意义重大。目前，半滑舌鳎性别决定机制尚不十分清楚，且没有发现决定其性别分化的决定基因。因此对半滑舌鳎性别决定相关基因进行功能分析显得非常紧迫，可以为人工控制半滑舌鳎性别提供基础资料。 本研究根据半滑舌鳎全基因组测序获得的部分序列，通过中间序列验证及RACE末端扩增，得到半滑舌鳎HH信号通路csshh、csdhh、csptch1 x1、csptch1x2、cssmo等5个基因的cDNA全长;通过RT-PCR分析了csshh、csdhh、csptch1x1、csptch1 x2、cssmo、csgli1等6个基因在早期胚胎发育、雌雄成体不同组织、雌雄性腺发育不同期的表达;检测了csshh、csdhh、csptch1 x1等3个基因启动子区的甲基化程度;通过FISH定位分析了csptch1 x1与csptch1 x2在染色体中的位置;通过ISH定位分析了csdhh、csptch1 x1及csptch1 x2在雌雄性腺中的表达;构建了csshh、csptch1 x1与csptch1 x2的原核表达载体及csshh与csdhh的真核表达载体。主要研究结果如下: 1.克隆得到半滑舌鳎HH信号通路的5种基因，分别将其命名为csshh、csdhh、csptch1 x1、csptch1 x2、cssmo。序列结构分析结果显示:csshh基因全长1922 bp，其中5'UTR266 bp，3'UTR360 bp，ORF1296 bp，编码432氨基酸，经预测该多肽的相对分子质量为47.28 kDa，理论等电点6.95。csdhh基因全长2473bp，其中5'UTR475 bp，3'UTR612 bp，ORF1386 bp，编码432氨基酸，经预测该多肽的相对分子质量为51.38 kDa，理论等电点8.17。csptch1 x1基因全长5212bp，其中5'-UTR298 bp，3'-UTR282 bp，ORF4269 bp，编码1543氨基酸，生物序列分析显示编码区有12次跨膜蛋白，有固醇敏感多肽区(sterol-sensing domain，SSD，并且信号肽区没有酶切位点。软件预测成熟csptch1 x1的蛋白为171.5 KDa，等电点是6.29，同时氨基酸序列有很多的修饰位点。csptch1 x2基因和csptch1 x1高度同源，全长5773 bp，5'UTR66 bp，3'UTR769 bp，ORF4638 bp，编码1545个氨基酸，结构预测有csptch1 x1基因特征的12个跨膜区及SSD区。cssmo cDNA序列2535 bp，其中5'UTR98 bp，3'UTR232 bp，ORF2205 bp，推测ORF区编码736个氨基酸残基，蛋白分子大小为83.14 kDa，等电点为8.35。 2.在胚胎期的相对定量结果显示:半滑舌鳎HH信号通路6种基因的表达量从囊胚期开始上升，在表达上均呈现先上升再下降的趋势。csdhh基因、cssmo基因与csgli1基因在神经胚期的表达量最高，显著高于其它时期，而csshh基因、csptch1 x1基因及csptch1 x2的相对高表达分别出现在囊胚期、体节期以及胚孔关闭时期，均处于细胞分化的关键时期，这说明HH信号通路在胚胎的分化及组织器官的形成中发挥重要作用。 3.在雌雄成鱼8个组织的定量结果显示:HH信号通路在脾、肝、脑、肾、肠、皮、心、性腺等8种组织中都有一定表达，与各组织的发生过程都密切相关。其中csdhh与csptch1 x1、cssmo及csgli1基因共同的表达特征是在雄性精巢高表达，因此推测csdhh-csptch1 x1-cssmo-csgli1信号通路对精巢的发生至关重要。csshh基因与csptch1 x2基因在肝及脑中高表达，在雌性性腺的表达高于雄性，二者表达模式类似，因此我们推测跨膜蛋白csptch1 x2基因是膜外csshh的受体，处于统一信号轴上，并且对多种组织器官的发生产生重要作用，尤其是雌性腺的发育。 4.不同发育时期的性腺表达分析显示:csdhh基因在雄鱼仔鱼出膜后35-65d微量表达，从80d起呈现上升趋势，在出膜后150d达到最高值，在1龄和2龄时有所下降，并且从95d起，精巢中的表达量始终显著高于卵巢，说明csdhh基因在性腺分化和精巢功能发挥上起重要作用。csdhh与csptch1 x1、cssmo及csgli1基因均在雄性性腺分化的关键时期95d较前期显著升高，且在雄性及伪雄1龄时的精巢表达显著高于卵巢中的表达，进一步说明csdhh-csptch1 x1-cssmo-csgli1信号通路对精巢的发生至关重要。分析csshh基因的表达发现，在仔鱼发育50-65d雌性性腺分化起始阶段，雌性性腺中csshh基因的相对表达量高于雄性个体，而在仔鱼发育80-95d既雄性性腺分化起始阶段，雄性性腺中csshh基因的相对表达量高于雌性个体，csshh基因在8月龄、1龄及2龄雌、雄及伪雄性腺中的表达，发现各时期卵巢的表达显著高于雄鱼及伪雄鱼精巢中的表达，因此推测csshh基因和性腺组织分化及卵巢发育有一定关系。csptch1 x2在雌性性腺特异表达，且在性腺分化的关键时期50天显著上升，在仔鱼发育65-80d时低表达，和csshh基因的表达模式类似，由此推测csptch1 x2可能是csshh基因信号通路调控过程中的膜上受体，在性腺分化及雌性性腺发育中起重要作用。 5.性腺组织csdhh、csshh、csptch1 x1等3个基因启动子区的甲基化程度结果显示:其甲基化程度和该基因的表达正相关，既甲基化程度高抑制该基因的表达。 6.组织原位杂交结果显示，csdhh和csptch1 x1杂交信号主要在1龄精巢的初级精母细胞、次级精母细胞、精子细胞及支持细胞中表达，而在卵巢中的表达极其微弱。csptch1 x2在半滑舌鳎雌雄均有表达。在半滑舌鳎雌性性腺中，定位于原始生殖细胞、卵原细胞、卵母细胞和滤泡细胞;在雄性性腺定位表达于精原细胞、支持细胞、精母细胞、精子细胞和精子，且卵巢中表达量高于精巢，且1龄雌雄性腺中的表达高于8月龄的表达，进一步直观说明HH信号通路在生殖细胞发育方面起重要作用。 7.染色定定位结果显示:csptch1 x1与csptch1 x2定位于常染色体而非性染色体上。 8.真核及原核表达载体的构建为后续深入进行功能研究奠定基础。
半滑舌鳎;HH信号通路;基因克隆;基因表达;功能分析
中国海洋大学
博士
水产养殖
温海深
2015
中文
Q959.486
126
2016-03-30（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）