许氏平鮋繁殖与免疫相关基因克隆及表达分析
本文主要从以下几个部分进行论述： 1.许氏平鲉促性腺激素受体基因克隆与不同发育时期表达分析 本章使用RT-PCR及RACE全长克隆技术得到了许氏平鮋促性腺激素受体(GTHR，促滤泡激素受体，FSHR;促黄体激素受体，LHR)，许氏平鮋FSHR共编码703个氨基酸，与欧鳎(Dicentrarchus labrax)和金头鲷(Sparus aurata)的同源性最高，分别为78％和73％。许氏平鮋LHR共编码703个氨基酸，与狼鲈(Dicentrarchus labrax)和金头鲷(Sparus aurata)的同源性最高，分别为79％和76％。同时，组织表达分析发现，GTHR也在非性腺组织中也有表达。使用荧光定量表达分析结果发现，许氏平鮋的FSHR随着性腺发育表达量下降，而LHR的mRNA的高表达量出现在性腺发育晚期。这个结果说明这两个基因在性腺发育中的不同时期发挥了重要功能。 2.许氏平鲉P450c17芳香化酶的克隆与繁殖表达分析 在脊椎动物中，芳香化酶P450c17对雄激素和雌激素的产生起到了重要的作用，本章克隆了许氏平鲉P450c17-Ⅰ和P450c17-Ⅱ两个基因全长。P450c17-Ⅰ和P450c17-Ⅱ分别有515和533个氨基酸。研究发现，P450c17-Ⅰ和P450c17-Ⅱ蛋白与牙鲆的同源性最高，分别为92％和81％。本研究阐述了许氏平鲉P450c17主要是在性腺，肾以及头肾中表达。荧光定量PCR分析了许氏平鲉P450c17-Ⅰ和P450c17-Ⅱ基因在发育期内的表达模式。本章内容可以为研究P450c17s的序列结构以及表达模式提供信息。 3.许氏平鲉Vasa基因的克隆与不同发育时期表达分析 Vasa，是DEAD-box蛋白家族的成员，在原始生殖细胞增殖中起关键作用。然而，vasa基因在卵胎生鱼类中还未见报道。本章使用RT-PCR和RACE技术克隆得到了许氏平鲉vasa基因全长。许氏平鲉Vasa包括650个氨基酸，与长丝鲈Vasa蛋白的同源性最高，为84％。组织表达分析结果显示vasa仅在性腺中表达，说明其在性腺发育中的特异性作用。另外，时间表达研究结果表明，雄鱼中的许氏平鲉vasa的表达量在精子发生期比在排精期高。而在雌鱼中，vasa早期发育的卵巢的表达量比晚期高。这些结果说明，Vasa在性腺发育早期过程中起到了重要作用。 4.许氏平鲉Foxl2克隆与表达分析 Foxl2是最近发现的一个翼状螺旋/叉头状转录因子超家族的成员。可以调解卵巢中芳香化酶，在雌性性腺分化起到重要的作用。为了探究Foxl2在性腺和脑中的作用，我们从许氏平鲉卵巢中克隆了Foxl2基因全长，并且研究了其在许氏平鲉各组织中的表达情况，以及在各发育期中性腺和脑内表达模式。组织表达发现，Foxl2只是在肝脏，脂肪，鳃，脑和卵巢中有表达，但是在精巢中没有检测到表达。荧光定量PCR检测其周期表达，结果可能说明了Foxl2在许氏平鲉中可能参与了卵巢的发育。 5.许氏平鲉热休克蛋白HSP70基因克隆与表达分析 本章使用同源克隆与RACE快速扩增法，克隆了许氏平鲉HSP70全长基因。该基因全长2259bp，编码639个氨基酸。Blast分析表明，许氏平鲉与尖吻鲈，罗非鱼和五条鰤同源性最高(88-89％)。同时，利用RT-PCR技术，研究了HSP70在许氏平鲉各组织中的表达情况。结果发现，HSP70在许氏平鲉各组织中表达广泛。荧光实时定量PCR技术测定许氏平鲉HSP70在不同发育时期的性腺和脑中的表达。结果说明在30min低氧处理后，鳃和卵巢中HSP70表达升高，然后再60min时下降，而脾脏和肝脏中是逐步上升直到60min达到最大值。另外，在鳃，脾和肝脏中，HSP70的表达量在一个小时不同的氧气浓度处理后达到了最大值。同时，我们还发现在30min低氧处理和60min正常氧气处理组，T3和T4的值是最大的。所有的这些结果都会为我们进一步研究HSP70对卵胎生鱼类的生理与免疫功能提供信息。 6.许氏平鲉热低氧诱导因子HIF-αs克隆与表达分析 在水体中，低氧环境是外界环境中常见的胁迫因子，氧气的平衡对于生物的生存及发育都非常重要。低氧诱导因子在生物体中对氧气的自动调节和生物体自身免疫反应其重要作用。HIFs二聚体包含两个亚基，HIF-α和HIF-β属于碱性螺旋环结构结构，PAS家族转录因子。到目前为止，有三种类型的HIF-αs从哺乳动物中克隆得到，而在鱼类中一般有两种类型的HIF-αs，及HIF-1α和HIF-2α。本文共获得许氏平鮋低氧诱导因子HIF-1α和HIF-2α两个基因，并且分析了HIF-αs在鱼类及其他物种中的系统进化关系。同时，利用RT-PCR技术，研究了HIF-αs在许氏平鲉各组织中的表达情况。结果发现，HIF-2α许氏平鲉各组织中表达广泛，而HIF-1α仅在性腺，头肾及脑中表达。在低氧处理中，许氏平鲉的HIF-1α在卵巢中的表达量在30min时迅速上升，然后在60min的时候下降，并且表达水平比对照组要高，然而，HIF-2α的水平在低氧的条件下下降。这些研究结果为我们进一步研究许氏平鮋的免疫机制提供了信息。 本研究完成的内容有: 1.完成了许氏平鲉促性腺激素受体，细胞色素P450，Vasa，Foxl2，HSP70以及HIF-αs等基因的克隆和序列分析。 许氏平鲉作为卵胎生鱼类，研究其繁殖生理和免疫生理具有重要意义。作者克隆共9个基因序列，填补了许氏平鲉卵胎生鱼类在这些重要繁殖和免疫基因中的信息空白。同时作者分析了相应的蛋白序列，综合氨基酸同源性比对分析，对其系统地位及亲缘关系进行了分析。 2.在mRNA基因表达水平上对这些重要基因进行了探索。 鱼类的繁殖相关基因及免疫相关基因，对于其生长和发育都起到了极其重要的作用。目前对于硬骨鱼的营养需求和毒理反应研究较多，而对其基础生理研究较少，因此这些基因在组织表达分析以及不同发育时期中的表达研究并不多见。在本工作中，作者主要对FSHR，LHR，P450-Ⅰ，P450-Ⅱ，Vasa，Foxl2，HSP70，HIF-1α和HIF-2α等基因在成鱼的性腺、肝脏、脾脏、肾脏、脑、肠、鳃、心、胃、脂肪、盲囊、头肾和肌肉表达进行了分析。同时增加了部分基因在雌雄性腺发育中的表达模式，首次在卵胎生性腺发育周期中完成了这些基因的表达探索。此外，作者还增加了免疫相关基因HSP70，HIF-1α和HIF-2α在不同氧气浓度的环境中表达模式探究。 3.在不同氧气浓度环境中检测了血清中甲状腺原氨酸(T。)、甲状腺素(T4)及皮质醇水平。 甲状腺原氨酸及甲状腺素影响生物体的生长发育，代谢，免疫等许多生理过程。皮质醇激素是一种糖皮质激素，主要功能时通过糖异生过程增加血糖，提高免疫力。在本研究中，作者主要对血清中的甲状腺原氨酸，甲状腺素及皮质醇水平进行了测定，从而探究其在鱼类生理及免疫等方面起到的作用。
许氏平鮋;繁殖性能;基因克隆;组织表达;周期表达;免疫机理
中国海洋大学
博士
水生生物学
温海深
2014
中文
Q959.499
149
2016-03-30（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）