重组琼胶酶AgaD的高效表达及初步研究
琼胶来源于紫菜、石花菜等红藻细胞壁，主要成分为硫琼胶和琼脂糖，琼脂糖由β-D-呋喃半乳糖和3，6-内醚-α-L-呋喃半乳糖通过β-1，4-糖苷键和α-1，3-糖苷键交替连接而成。琼胶酶是降解琼脂糖产生琼胶寡糖的一类糖苷水解酶，根据其降解琼脂糖的方式可以分为α-琼胶酶和β-琼胶酶。目前已经报道的琼胶酶多为β-琼胶酶，分属于糖苷水解酶GH-16、50、86和118家族，而α-琼胶酶数量非常少，仅有4个，均属于GH-96家族。β-琼胶酶降解琼脂糖的β-1，4糖苷键产生新琼寡糖，α-琼胶降解α-1，3糖苷键产生琼寡糖。琼胶寡糖属于中性糖，具有多种生物学活性，是一种潜在的益生元寡糖。 课题组前期从青岛海域分离得到一株产琼胶酶的菌株Thalassomonassp.LD5，通过构建野生菌株的基因组文库结合兼并PCR和site-finding PCR的方法获得了琼胶酶编码基因agaD，其开放阅读框长4401 bp，编码1466个氨基酸。序列分析表明，AgaD与GH-96家族已有文献报道的两个α-琼胶酶成员的氨基酸序列相似性分别达到了77％和89％。对AgaD野生酶和初步表达的重组酶研究发现其产量均非常低(重组酶仅有20U/L)，因此提高重组酶AgaD的产量对后续研究非常必要。本研究首先探讨了密码子适用性对agaD重组表达的影响，通过基因合成的方法合成了优化后的基因optagaD;选择了三种不同的E.coli表达宿主，结果表明，目的基因在AD494(DE3)宿主中表达的酶活最高，达到450U/L发酵液，表明二硫键的形成可能对酶的正确折叠具有重要的作用;根据N端法则，研究了N端第二个氨基酸替换后对重组酶的影响，结果表明将苯丙氨酸(Phe)替换为丙氨酸（Ala)后,胞外酶产量提高了近5倍，并且重组酶的发酵时间缩短了一半;最后，探究了不同的发酵条件及培养基添加成分对产酶量的影响，确定了500 mL瓶中的最适装样量为50 mL，最适诱导剂浓度为0.0004mol/L，诱导温度为25℃，添加CaCl2至浓度0.005-0.02 mol/L、甘氨酸(Gly)至浓度0.1 mol/L均可以明显提高胞外酶的产量。最终经过表达宿主、N端法则、发酵条件、培养基等优化，发酵液上清中重组琼胶酶AgaD的产量由20U/L提高到了11300 U/L，提高了近500倍，为琼胶酶AgaD的深入研究奠定了基础。 接下来我们探讨了重组酶的分离纯化条件，重组酶可以被60％饱和度的硫酸铵沉淀，但是硫酸铵对酶活有明显的抑制作用，不利于后期的分离纯化检测，NaCl替代实验发现尽管菌株LD5分离自海洋细菌，但是重组琼胶酶AgaD表现出非常强的NaCl抑制性，当浓度达到2mol/L时，活力下降了一半以上。相反，CaCl2可以明显促进酶的活力，在0.05 mol/L CaCl2存在时即使NaCl浓度达到4mol/L酶活力仍然可以维持稳定在原来的90％以上;构建了携带Flag标签的重组蛋白，分别利用His标签抗体及Flag标签抗体对纯化的蛋白进行了Western-blot检测，结果表明两种抗体检测均出现多个条带，该结果与凝胶原位复性方法检测结果一致，进一步表明目的蛋白发生了不同程度的剪切或断裂，导致纯化的蛋白在SDS-PAGE上呈现出不同大小的片段。 利用纯化后的重组蛋白研究了AgaD降解琼脂糖的终产物，薄层层析及荧光辅助电泳显示终产物的迁移率与琼三糖相似;使用用不同聚合度的新琼寡糖作为底物分析了AgaD的催化腔特征，结果表明AgaD不能降解新琼二糖和四糖，对新琼六糖仅能部分降解，而新琼八糖和十糖可以完全降解,因此我们认为该酶的催化腔最小可以容纳六个糖单元;AgaD降解琼脂糖的降解曲线表明，该酶降解琼脂糖的方式为内切。 在后续研究中我们将进一步对重组蛋白AgaD的剪切或断裂机制进行研究。此外，我们在分离纯化重组酶中发现选用的几种宿主菌均能够表达β-半乳糖苷酶和α-半乳糖苷酶，而这些酶在分离纯化过程中不容易去除，导致AgaD的降解产物可能进一步发生降解，因此无法利用产物的还原端正确判定AgaD的属性，因此我们将通过更换宿主菌或者基因敲除的方式，以及其他的分离纯化手段获得不含有半乳糖苷酶的重组蛋白，并利用核磁、质谱等方法研究AgaD产物的属性。
琼胶酶;重组表达;分离纯化;降解方式
中国海洋大学
硕士
微生物与生化药学
于文功
2015
中文
Q513.2
103
2016-03-30（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）