热纤梭菌纤维小体调控因子的结构和功能研究
热纤梭菌（Clostridium thermocellum）是目前自然界中已知的降解木质纤维素最高效的微生物之一，是利用木质纤维素生产生物能源和化学品的理想菌株。热纤梭菌拥有高效的多酶复合体称为纤维小体，可以将植物细胞壁中的多糖分解成可溶性的糖。已有的研究发现，热纤梭菌纤维小体的组成受到细胞外底物种类的调控，其调控机制可能是通过多个sigma和anti-sigma因子对来完成的。了解sigma-anti-sigma因子之间的信号传导机制，有助与对纤维小体进行定向改造，开发高效降解木质纤维素的体系。二级结构预测和跨膜预测分析表明，调控纤维小体表达的anti-sigma因子是跨膜蛋白，具有一个胞外的多糖结合结构域，一个跨细胞壁的无序区，一个周质空间结构域，一个跨膜螺旋和一个胞内结构域。本文选择了热纤梭菌ATCC27405中Cthe_0267编码的anti-sigma因子RsgI2作为研究对象，综合利用了分子生物学技术、蛋白质生化技术及核磁共振(nuclearmagnetic resonance，NMR)技术对RsgI2进行了以下研究: (1)热纤梭菌anti-sigma因子胞内结构域的表达纯化及NMR结构测定将RsgI2的胞内结构域克隆到pET-30a(+)载体上，在大肠杆菌中进行过表达，产生C端融合有一个His6标签的重组蛋白。通过Ni2+亲和层析和阴离子交换层析对该胞内结构域进行了纯化。通过替换培养基中的唯一氮源和碳源获得15N/13C同位素标记的蛋白样品，使用这些样品进行NMR实验。对获得的NMR数据进行处理和分析获得了主链和侧链的化学位移指认，通过结构计算最终获得NMR溶液结构。RsgI2胞内结构域含有四个β折叠片，是一种OB-fold的β桶的折叠类型。该折叠类型广泛存在于结合核酸、多糖和一些特殊配基的蛋白质中。RsgI2胞内结构域上存在的显著疏水暴露表面，推测可能是sigma因子的结合区域。 (2)热纤梭菌anti-sigma因子周质空间结构域的表达纯化及NMR结构测定将RsgI2的周质空间结构域克隆到pET-30a(+)载体上，在大肠杆菌中进行过表达，产生在C端融合有一个His6标签的重组蛋白。通过Ni2+亲和层析和凝胶过滤层析对该周质空间结构进行了纯化。制备核磁样品进行NMR实验，对NMR数据进行处理和分析获得了主链和侧链的化学位移指认，最终经过结构计算获得NMR溶液结构。RsgI2周质空间结构域是包含7个α螺旋和6个β片的α/β蛋白，呈现为一种α/β/α三明治型的整体结构。该结构的拓扑方式在已知的蛋白质结构中未能搜索到类似结构，是一种新的折叠类型。这两个结构域的解析为sigma-anti-sigma因子之间的信号传导机制的研究奠定了基础。 (3)Sigma-anti-sigma因子信号传导机制的初步研究 纯化与RsgI2相对应的sigma因子SigI2，与纤维小体相关基因的启动子区域进行电泳迁移率(electrophoretic mobility shift assay，EMSA)实验来研究启动子的识别机制。结果显示，SigI2可以与纤维小体中最主要的纤维素酶CelS的启动子、同样感应纤维素底物的SigI1的启动子结合;与SigI不能结合的SigA的启动子没有相互作用。证明了SigI能识别纤维小体相关基因的启动子。尝试使用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、凝胶过滤层析和NMR滴定实验研究RsgI2胞内结构域与SigI2之间的识别机制。SigI2无法进入凝胶，因此非变性聚丙烯凝胶电泳不能用来检验两者的相互作用;但是凝胶过滤层析和NMR滴定结果显示两者有相互作用，表明sigma因子与对应的anti-sigma因子能相互识别。这些结果为进一步通过突变分析和结构功能分析研究其信号传导机制提供了基础。
热纤梭菌;纤维小体;anti-sigma因子;结构特征;功能分析
中国海洋大学
硕士
微生物与生化药学
李文利
2015
中文
Q93-3
84
2016-03-30（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）