不同亚型OGT多克隆抗体的制备与特异性分析
O-GlcNAc(O-linked N-acetylglucosamine)糖基化修饰是一种细胞内动态的蛋白质翻译后修饰。O-GlcNAc糖基转移酶(O-linked N-acetylglucosamine transferase transferase，OGT)以UDP-GlcNAc作为供体底物，将单个N-乙酰葡萄糖胺(N-acetylglucosamine，GlcNAc)与蛋白质的丝氨酸或苏氨酸的羟基形成O-糖苷键，而这种修饰的去除是由糖苷酶(O-GlcNAcase，OGA)完成的。细胞内超过3000种蛋白具有O-GlcNAc修饰，O-GlcNAc修饰参与了细胞信号转导、配受体相互作用、病毒感染、转录调节、细胞分化、细胞应答以及蛋白质翻译与降解等生物过程。不仅如此，近年来的很多研究结果表明，蛋白质O-GlcNAc修饰的异常与糖尿病、神经退行性疾病、癌症等多种重大疾病的发生有密切关系。 人类的基因组中只存在一个编码OGT的基因，其基因表达产物主要有3种OGT亚型，分别为ncOGT(nucleocytoplasmic OGT)、mOGT(mitochondrial OGT)、sOGT(short OGT)。这三种亚型OGT主要的不同是N-末端的TPRs结构，其中，最长的亚型是ncOGT，它的N端包含12个TPRs;较短的亚型是mOGT，它的N端包含9个TPRs，并且有一段信号肽将其定位于线粒体膜内;最短的OGT亚型是sOGT，它仅有2.5个TPRs。但是，这几种OGT亚型的C末端的催化结构域却是相同的。目前，有关O-GlcNAc修饰及OGT的研究进展较慢，其主要原因就是缺少有利的研究工具;因此，为了进一步探讨OGT的生理和病理作用，需制备能高效特异性检测OGT的抗体。 因所有三个OGT亚型包含相同的催化结构域，故为制备能够同时有效识别3种OGT亚型的抗体，我们选择了OGT的催化结构域为抗原片段，制备抗OGT-C抗体。为进一步研究mOGT在线粒体中的功能，我们选取mOGT的N末端的特异性氨基酸序列为抗原片段制备能够特异性识别mOGT的抗体，从而为mOGT的研究提供有利的工具。 为了制备抗OGT-C抗体，本研究在NCBI数据库中，查找人源OGT基因序列，根据OGT的结构特点，选取OGT的C末端催化结构域中的一段多肽序列（556-1046位点氨基酸）做抗原。我们首先利用基因工程技术成功构建OGT的C末端催化结构域（556-1046位点氨基酸）的重组表达载体pET30-a-OGT-C，转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，IPTG诱导表达融合His标签的OGT-C蛋白，Ni+珠亲和层析法纯化提取OGT-C蛋白，进一步通过透析、浓缩，最终获得浓度为1 mg/mL的OGT-C重组蛋白溶液。再以OGT-C重组蛋白作为抗原，免疫Wistar大鼠制备多克隆抗体，并用ELISA法检测OGT抗体的效价，Western blotting鉴定抗体特异性。本论文中OGT-C多抗效价达1∶80000;在免疫印迹实验中，此多抗可以高效的检测重组抗原，并可以特异性检测培养细胞内源表达的ncOGT和mOGT这2种OGT亚型。因此，本论文获得高效价、高特异性的OGT多克隆抗体，在OGT的生物学研究中可以用于检测ncOGT和mOGT的表达。 而对于mOGT多克隆抗体的制备，则是在GenBank数据库中查找ncOGT、mOGT和sOGT的序列，利用BioEdit软件对OGT三个亚型的序列进行比对，找到mOGT的特有序列（55个氨基酸的长度）;并选择mOGT N端其中的两个肽段，分别命名为m-1、m-2。合成肽端m-1:MISPSSPPPPNL（mOGT的N-端第14-25个氨基酸），与肽段m-2: SHLLSLTPPKACYL（mOGT的N-端第42-55个氨基酸），应用戊二醛法偶联m-1、m-2与KLH，制备完全抗原，再将该抗原免疫新西兰白兔中制得多克隆抗体，用ELISA法检测其抗体效价，Western blotting鉴定分析其特异性。本论文中mOGT多抗效价达1∶100000;在免疫印迹实验中，此多抗可以高效的检测抗原，并可以特异性识别培养细胞内源表达的mOGT这种OGT亚型。 综上所述，本论文依据分子克隆及多克隆抗体制备原理，获得高效价、高特异性的OGT多克隆抗体以及高效价的mOGT多克隆抗体，可以应用于OGT的生物学研究中。
O-GlcNAc糖基转移酶;多克隆抗体;制备工艺;特异性分析
中国海洋大学
硕士
生药学
顾玉超
2015
中文
R392
80
2016-03-30（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）