左卡尼汀和甘露糖醛酸寡糖对高糖诱导视网膜神经节细胞凋亡的保护作用
糖尿病视网膜病变(Diabetic Retinopathy，DR)是2型糖尿病最常见的并发症，目前已成为最主要的致盲眼病之一。DR的发生机制尚未明确，目前认为氧化应激是其中的一个关键环节。本研究通过体外实验分别探讨了左卡尼汀(L-Carnitine，LC)及褐藻酸寡糖抗氧化应激的神经保护作用。首先考察了糖尿病及其并发症（尤其是DR）患者血浆左卡尼汀、乙酰左卡尼汀(Acetyl-L-carnitine，ALC)和丙酰左卡尼汀(Propionyl-L-carnitine，PLC)的含量变化;通过建立高糖诱导的视网膜神经节细胞(Retinal ganglion cells，RGCs)凋亡模型，观察高糖状态下RGCs凋亡情况，探讨LC和不同分子量甘露糖醛酸对高糖状态下RGCs凋亡的保护作用及抗氧化机制;着重研究了LC对Nrf2-Keap1-ARE通路的调控作用;最后，对两种组分的协同作用进行评价。 (1)非干预收集健康志愿者（76例）、2型糖尿病患者（59例）以及糖尿病并发症患者（糖尿病视网膜病变74例、早期糖尿病肾病51例、糖尿病周围神经病变57例、糖尿病高血压69例、糖尿病性冠心病64例）的临床指标及血浆样本，采用柱前衍生荧光HPLC法检测LC、ALC和PLC的含量。结果表明糖尿病组的血浆LC浓度明显低于正常对照组（P＜0.05），其他并发症组LC浓度又明显低于糖尿病组（P＜0.05），但各并发症组间比较无明显差异（P＞0.05）。结果提示对于糖尿病患者，尤其是糖尿病并发症患者来说，补充LC可能是有益的。 (2)高糖状态下，LC对高糖状态下RGCs凋亡的保护作用及其抗氧化机制。原代培养RGCs，根据台盼蓝拒染实验观察细胞的存活情况，最终选择30mmol·L-1葡萄糖浓度干预48 h，建立高糖模型;MTT法测定细胞活力提示以50-200μmol·L-1 LC促细胞活性作用最佳;Hoechst33342染色结果显示不同浓度LC组细胞凋亡率明显低于高糖损伤组（P＜0.01或P＜0.05），提示LC能够抑制高糖所致的RGCs凋亡。LC组活性氧(Reactive oxygen species，ROS)、丙二醛(Malondialdehyde，MDA)水平较高糖损伤组显著下降（P＜0.01或P＜0.05），而超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase，GSH-Px)和过氧化氢酶(Catalase，CAT)活性以及总抗氧化能力(Totalanti-oxidation capability，T-AOC)与模型组相比较显著升高（P＜0.01或P＜0.05），且效应呈剂量依赖性。结果提示LC可通过增强细胞的抗氧化能力抑制高糖所致的细胞凋亡。 (3)高糖状态下，LC对RGCs凋亡过程中Nrf2-Keap1-ARE通路的调控作用。结果显示LC组Nrf2蛋白表达比高糖组显著增多(P＜0.01或P＜0.05);而Keap1蛋白表达与高糖组比较无显著性差异（P＞0.05），血红素加氧酶(HO-1)和γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)的蛋白表达均比高糖组显著增强(P＜0.01)，且呈剂量依赖性，提示LC可能通过激活Nrf2-Keap1-ARE通路，增加下游抗氧化物酶HO-1和Ⅱ相解毒酶γ-GCS的表达，进而对高糖状态下RGCs的氧化应激性损伤发挥保护作用。 (4)在课题组前期鉴定出甘露糖醛酸M段的四个组分(MH-1、MH-2、MH-3、MH-4)的基础上，探讨不同分子量的甘露糖醛酸预处理对细胞活性的影响。结果显示，在10-1000μg·ml-1范围内不同分子量的甘露糖醛酸可拮抗高糖对RGCs凋亡的影响(P＜0.01)。Hoechst33342染色显示不同分子量甘露糖醛酸均能够抑制高糖损伤所致的RGCs凋亡，其在浓度为100tg·ml-1时的保护作用排序为MH-1＞MH-2＞MH-4＞MH-3;不同分子量甘露糖醛酸组ROS水平较高糖组显著下降(P＜0.01)，均能逆转高糖引起的MDA的升高(P＜0.01)，减轻脂质过氧化，抗氧化酶SOD、GSH-PX和CAT活性以及T-AOC与高糖组相比均显著升高(P＜0.05)。结果提示不同分子量甘露糖醛酸可通过增强细胞的抗氧化能力抑制高糖所致的细胞凋亡。 (5)探讨左卡尼汀与甘露糖醛酸寡糖对高糖诱导RGCs凋亡的协同保护作用。选择对RGCs凋亡保护作用最强的MH-1三个浓度分别与LC混合，Hoechst33342染色检测细胞凋亡发现现在相同条件下，甘露糖醛酸寡糖MH-1段对RGCs凋亡的保护作用略低于左卡尼汀。三组混合组凋亡率比较发现，低浓度混合组对RGCs凋亡的保护作用高于低浓度LC组，又高于低浓度MH-1组和中浓度MH-1组，中浓度混合组对RGCs凋亡的保护作用高于MH-1(M)组，与LC(M)无显著性差异，高浓度混合组对RGCs凋亡的保护作用高于MH-1(H)组，与LC(H)组无显著性差异，LC和甘露糖醛酸寡糖低、中、高浓度联合组的CDI(The coefficient of drug interaction)分别为0.598，、0.971、1.350。说明左卡尼汀与甘露糖醛酸寡糖混合作用于高糖诱导的RGCs凋亡具有协同增效的作用。
糖尿病视网膜病变;左卡尼汀;甘露糖醛酸寡糖;抗氧化机制;视网膜神经节细胞
中国海洋大学
博士
药物化学
管华诗
2014
中文
R774.1;R988.1
127
2016-03-30（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）