模拟酶Cu(Ⅱ)配合物的制备及其对肽键的水解作用
肽键水解技术在蛋白质的测序、功能性多肽的制备、多肽类药物的开发等领域有着十分广泛的应用。在食品工业上，为了获得理想的风味和功能特性，需要对蛋白质中的肽键进行适度的水解，例如:蛋白质水解后的溶解度、乳化性质、发泡性质等会改变。目前，肽键水解的方法主要有四种:酶水解、强酸强碱水解、无机小分子和有机分子水解、金属配合物水解。这些水解方法存在着很多不足之处，例如:催化反应条件较苛刻、具有较强的挥发性和毒性等。因此，合成出具有天然酶优点，又无上述缺点的蛋白模拟酶具有重要意义。 本文利用甲醇、甲醛、乙二胺、乙醇胺等试剂，在模板合成法的基础上进行改进，制备出对肽键有较强水解作用的模拟酶氮杂冠醚Cu(Ⅱ)配合物。通过FTIR和UV-vis分光光度计对配合物进行了表征，同时研究了该配合物在不同条件下的稳定性。利用SDS-PAGE、HPLC、MALDI-TOF-MS、LC-MS等手段探讨了其对肽键的水解能力、水解位点和水解过程。结果如下: (1)以肌红蛋白、溶菌酶、卵清蛋白和牛血清蛋白四种空间结构不同的蛋白质为底物，研究了氮杂冠醚Cu(Ⅱ)配合物对蛋白质中肽键的水解效果。SDS-PAGE图谱显示:在温度为60℃的条件下，该配合物对肌红蛋白、卵清蛋白和牛血清蛋白中的肽键有一定的水解作用（水解度:牛血清蛋白＞卵清蛋白＞肌红蛋白），对溶菌酶中的肽键不具有水解作用。其中:对牛血清蛋白和卵清蛋白具有外肽酶的水解特征，对肌红蛋白具有内肽酶的水解特征。 (2)通过对底物的筛选，选取了具有不同水解方式的肌红蛋白和牛血清蛋白为底物，研究了氮杂冠醚Cu(Ⅱ)配合物对蛋白质中肽键的水解能力和水解位点。SDS-PAGE图谱显示:在温度为60℃、反应3d的条件下，氮杂冠醚Cu(Ⅱ)配合物分别将肌红蛋白和牛血清蛋白水解40％和70％以上。MALDI-TOF-MS数据表明:氮杂冠醚Cu(Ⅱ)配合物选择性地断裂了肌红蛋白分子中Lys17-Val18、Lys79-Lys80和Lys97-His98肽键。氮杂冠醚Cu(Ⅱ)配合物的催化水解过程是通过与底物的各部位相互协调配合完成的，其催化水解肌红蛋白和牛血清蛋白的规律符合米氏方程。Linewaver-Burk双倒数法计算得到:水解肌红蛋白的Vmax为5.56×10-5 M·h-1，Km为7.18×10-3 M;水解牛血清蛋白的Vmax为1.00×10-4 M·h-1，Km为4.36×10-3 M。 (3)根据寻找出的水解位点，合成了含有相应位点的Q肽(G-K-H-Q-S-H-A-T)。以杆菌肽和Q肽为底物，研究了氮杂冠醚Cu(Ⅱ)配合物对多肽中肽键的水解能力和水解过程。HPLC数据表明:在温度为60℃、反应3d的条件下，氮杂冠醚Cu(Ⅱ)配合物分别将杆菌肽和Q肽水解80％和85％以上，氮杂冠醚Cu(Ⅱ)配合物水解杆菌肽的最适pH为6.5。LC-MS数据表明:该配合物在促进杆菌肽中肽键水解的同时，还能促进其分子中游离的氨基和羧基进行脱水缩合反应，形成新的肽键。氮杂冠醚Cu(Ⅱ)配合物对Q肽的水解，从另一个角度证明了该配合物对肌红蛋白的水解作用。氮杂冠醚Cu(Ⅱ)配合物催化水解杆菌肽和Q肽的规律符合米氏方程，Linewaver-Burk双倒数法计算得到:水解杆菌肽的Vmax为1.72×10-4 M·h-1，Km为3.50×10-3 M;水解Q肽的Vmax为1.44×10-4 M·h-1，Km为3.29×10-3 M。 综上所述，氮杂冠醚Cu(Ⅱ)配合物作为一种蛋白模拟酶，能够有效促进肽键的水解。这为进一步研究金属配合物模拟酶在食品和生物工业上的应用提供了理论指导和技术支持。
蛋白模拟酶;铜配合物;制备工艺;肽键水解技术
中国海洋大学
硕士
食品科学
汪东风
2015
中文
TQ464.8
78
2016-03-30（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）